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烟酰胺单核苷酸转移酶:脑缺血条件下神经元的存活调控者

王培  
【摘要】:目的缺血性脑卒中是造成死亡和残疾的主要原因之一,但目前有效的治疗药物非常少。寻找新的治疗靶标将有助于发展新的缺血性脑卒中治疗药物。烟酰胺单核苷酸转移酶(简称Nampt)是哺乳动物细胞内NAD+合成的限速酶,控制着细胞内的NAD+浓度,决定着细胞在应激下的命运。目前,关于Nampt在缺血性脑卒中的发生、发展及转归过程中的作用,仍是空白,本研究将对此进行研究。实验分为两个部分:(1)Nampt对脑缺血条件神经元的凋亡/死亡的影响;(2)Nampt对脑缺血条件神经元的自噬的影响。材料和方法采用整体动物和离体细胞的结合,主要使用大、小鼠的大脑中动脉堵塞模型(MCAO)和原代神经元细胞进行研究。运用了多种药理学和基因干预手段,例如Nampt的特异性酶抑制剂FK866、Nampt的酶产物NMN、慢病毒介导的Nampt过表达和RNA干扰等开展研究。使用免疫荧光双染、real-time PCR、Western blotting、流式细胞术、细胞活力、LDH释放、MAP2染色、脑室及脑局部微注射、免疫共沉淀、TUNEL染色等多种技术。最后,利用AMPK-a2和SIRT1基因敲除动物,进行更进一步的机制确认。结果 (1)Nampt在脑中主要表达于神经元细胞。在MCAO模型和缺氧缺糖处理的原代神经元细胞上,Nampt显著上调。在易卒中型高血压大鼠上,长期服用FK866可加速脑卒中的发生。FK866加重MCAO模型的脑损伤和缺氧缺糖导致的神经元损伤。这些作用可被Nampt酶产物NMN补充所逆转。使用慢病毒在脑局部或者在神经元上过表达Nampt,可减轻MCAO或缺氧缺糖导致的神经损伤。AMPK激活有神经保护作用。而过表达Nampt可进一步增加缺血或缺氧缺糖导致的AMPK激活,RNA干扰Nampt则可以抑制AMPK激活。AMPK的化学抑制剂Compound C可取消Nampt的神经保护作用。此现象在AMPK-a2敲除动物的神经元细胞上得到进一步证实。Nampt与AMPK共表达于神经元细胞,但二者之间却无直接相互作用。Nampt可通过控制NAD+合成来调控SIRT1的去乙酰化能力。AMPK的上游激酶LKB1,其乙酰化和细胞内的重分布均可受SIRT1调节。最后,在SIRT1和AMPK-a2的基因敲除动物上,Nampt的神经保护作用被取消。(2)在脑组织局部过表达Nampt后,MCAO手术2h的LC3 influx,但在8h和24h没有变化。在MCAO术后2h,Nampt过表达可增强或增加LC3-Ⅱ的表达、Beclin-1表达以及电镜下的自噬小泡数目,提示在脑缺血的早期Nampt可增强神经元的自噬。在离体培养的神经元上观察到同样的现象。自噬阻断剂3-MA可阻断Nampt过表达的部分神经保护作用,而自噬诱导剂rapamycin则可减轻Nampt敲减对缺血条件下的对神经的损伤作用。进一步的研究发现,Nampt过表达可降低mTOR和S6K1的磷酸化。而Nampt敲减则相反,可增加mTOR和S6K1的磷酸化,该变化可被rapamycin阻断。由于mTOR-S6K1信号通路是被TSC2所调节的,我们对TSC2的两个不同的磷酸化位点(Ser1387,Thr1462)进行研究。发现:Nampt过表达可增强Ser1387位点的磷酸化水平,对Thr1462无明显影响。最后,在SIRT1敲除的神经元上,Nampt过表达对自噬的调节作用被取消。结论 (1)Nampt可通过其酶活性,控制NAD+的合成,影响SIRT1的活性,调节LKB1的去乙酰化和细胞内重分布,最终调控AMPK的激活,减少神经元在缺血情况下的凋亡、死亡。(2)Nampt可通过改变TSC2Ser1387-mTOR-S6K1信号通路,在脑缺血的早期增加自噬的发生,以提高神经元在缺血下的存活。

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