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MicroRNA-126 regulates insulin signal pathways in INS-1 cell line

【摘要】:正Objective MicroRNAs(miRNA) are a large class of 20 -25 nucleotides that evolutionarily conserve small non - protein - coding RNAs that repress target gene expression by translational inhibition or mRNA. degradation.Although there is a close relationship between miRNAs and the development of type Ⅱ diabetes mellitus(DM2).However,the relationship between microRNA - 126(miR - 126) and the pathogenesis of DM2 remains unclear.The current study aims to investigate the regulation of miR - 126 on INS - 1 cell insulin signaling pathway in an attempt to provide new theoretical and potential therapeutic targets in DM2. Methods MiR -126 target genes were predicted by bioinformatics methods.INS - 1 cells were transfected with miR - 126 mimics,miR - 126 mutation,miRNA control mimics or Si - IRS1 for 48h and then stimulated with insulin(100 nM) for 12h.IRS - 1 and PIK3R2 protein expression was detected by Western blot.GAPDH expression was used for protein - level normalization.Transfection efficiency was determined by real - time PCR and fluorescence microscopy.Regulation of miR - 126 on INS - 1 cell proliferation was detected by MTT.Results To understand the role of miR - 126 in INS - 1 cells,PicTar or BibiServ was used to search for the potential direct mRNA targets of miR - 126.It was found that IRS - 1 and PIK3R2 3' - UTR contained potential miR - 126 binding sites.The free energy of the two potential binding complexes was - 19.3 and -19.4 kcal/mol respectively.To regulate miRNA expression in INS - 1 cells,miR - 126 mimics were transfected into them,and miRNA expression level was measured by quantitative PCR.The results showed that artificial synthetic miRNA mimics effectively regulated miRNA expression in vitro.To see whether miR - 126 could regulate IRS - 1 and PIK3R2 expression in INS -1 cells,they were transfected with miR -126 mimics, miR -126 mutation,miRNA control mimics or Si - IRS1 for 48h and then stimulated with insulin(100 nM) for 12h.Western blot showed that IRS - 1,PIK3R2 and Akt protein expressions were downregulated when either miR - 126 mimics or Si - IRS1 was introduced into insulin - stimulated INS - 1 cells.Phospho - Akt(P - Akt) expression was upregulated in a time - dependent manner when INS - 1 cells were stimulated with insulin (100 nM) for 0,1,5,10,30 and 60 min,but Akt protein expression did not change significantly.To explore the functional relevance of miR -126 in INS - 1 cells,the influence on proliferation of INS - 1 cells was observed by MTT.It was found that the proliferation of miR - 126 - overexpressed INS -1 cells was impaired compared to miR - CTL in the presence of insulin for 12 h.The absorbance of miR - 126 - overexpressed INS -1 cells decreased by 30.05%at 490 nm compared to miR - CTL group.Conclusions IRS - 1 or PIK3 R2 seems to be a target of miR - 126.MiR - 126 decreased the expression of IRS-1,PIK3R2 and downstream Akt protein by acting on the specific target sequence of IRS - 1 and PIK3R2 mRNA 3'- UTR in INS - 1 cells.Insulin promoted Akt phosphorylation in INS - 1 cells.MiR - 126 inhibited the IRS - 1/PI3K/ Akt signaling pathway by targeting on IRS - 1 and PIK3R2 mRNA,thereby inhibiting the proliferation of I NS-1 cells.These findings present possible therapeutic targets in DM2.

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