实时荧光PCR检测H_2S作用于腔出大鼠蛛网膜下血后血管内皮细胞c-fos、Caspase-3基因表达

【摘要】：目的应用实时荧光PCR检测H2S作用于大鼠蛛网膜下腔出血后血管内皮细胞c-fos、Caspase-3基因表达的变化。方法采用枕大池二次注血建立大鼠SAH后CVS模型,动物及分组:清洁级雄性SD大鼠90只,体重300±20g,随机分为3组,每组30只:(1)对照组;(2)SAH后CVS组;(3)SAH后CVS+NaHS组,于实验后第30分钟、3天、5天、7天、14天分别处死,用萃取法提取大鼠基底动脉血管内皮细胞总RNA,通过紫外分光光度计检测样品中RNA的浓度和纯度,并根据A260的值估计样品总RNA浓度,根据试剂盒说明书,梯度稀释模板cDNA制作标准曲线,从GeneBank查出相关引物序列,由美国国立卫生研究院用ABI Primer Express software(Applied Biosystems,Foster City,CA)帮助设计引物,并由Sigma公司合成,采用相对定量法以Ct值为统计参数依次计算下列数据Ctaverage=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管);dCt=Ctaverage-中间值;基因的表达=2^(-dCt);相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达。结果在CVS组c-fos在蛛网膜下腔出血后3天mRNA表达达高峰,7天开始下降,Caspase-3蛛网膜下腔出血后5d mRNA表达增加,下降缓慢;在CVS+NaHS组中c-fos表达明显增加并在3天达高峰,7天后下降,Caspase-3较CVS组表达降低3d后开始下降,后又逐渐升高14d后达高峰。其表达水平与对照组相均有统计学意义(p0.05)。结论促凋亡基因c-fos、Caspase-3在大鼠自发蛛网膜下蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛血管内皮细胞凋亡中起重要作用,H2S在其中具有积极作用。