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棉花线粒体atp9基因克隆及表达分析

史计  张晓  郭三堆  
【摘要】:根据GenBank报道的植物线粒体atp9基因编码区保守序列设计探针,进行Southern blot分析,发现棉花线粒体atp9基因在CMS系和保持系间存在差异。通过Tail—PCR方法,克隆到了atp9的基因组全长以及5'和3'侧翼部分序列,结果发现:在atp9基因起始密码子上游—17 bp至—13 bp处,CMS系与保持系相比缺失5个碱基(AATTT),使得CMS系中产生了1个新的EcoRⅠ位点(GAATTC),导致CMS系和保持系mtDNA在EcoRⅠ酶切时产生了RFLP多态性。利用热硼酸法提取棉花CMS系、保持系和恢复系幼蕾总RNA,以atp9基因编码区为探针,通过Northern blot分析发现三系中atp9基因的转录谱没有差异,都存在2个转录本:500 bp高丰度转录本和1000 bp低丰度转录本。RT—PCR分析发现,棉花atp9基因全长225bp,共编码74个氨基酸。在atp9基因编码区中存在7处C→U的RNA编辑位点,编辑位点分别位于第20、50、182、191、205、215、223 bp处;这7处RNA编辑导致第7、17、61、64、69、72位氨基酸发生如下改变:S→L、S→L、S→L、P→L、L→L、S→F,其中第75位由编码精氨酸的氨基酸转变为终止密码子使翻译提前终止。在保持系中,这7处RNA编辑位点都是完全编辑;在CMS系中,前4处位点都是完全编辑,后3处位点的编辑率是86.7%。RNA编辑为植物产生正常功能蛋白必要过程,可改变蛋白疏水性,增加物种间保守性。

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