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棉花抗逆相关新基因GhDr1的克隆及生物信息学分析

丁忠涛  张锐  梁成真  孙豹  林发壮  郭三堆  
【摘要】:棉花本身有一定的耐逆性,但随着干旱、土壤盐碱化、异常气候条件等环境条件的变化棉花产量和品质的提高遭遇了瓶颈。因此通过克隆棉花抗逆相关基因并通过基因工程的手段提高棉花的抗逆性是必要的。本研究在实验室已经克隆的棉花抗逆相关GhDr1基因片段的基础上开展了棉花抗逆相关基因的克隆及功能分析。通过筛选陆地棉Y18品系基因组BAC文库将GhDr1定位到348号单板B行6列。通过TAIL—PCR的克隆技术扩增得到GhDr1的5'端和3'端侧翼序列,最终获得的有关基因组序列全长为7037 bp。通过RT—PCR结合TAIL—PCR,得到1913 bp的GhDr1的cDNA序列。基因结构分析发现GhDr1含有4个外显子和3个内含子,转录起始位点位于翻译起始位点ATG上游492 bp处,符合PyPyANT/APyPy的特征。cDNA序列3'端Poly(A)结构位于终止密码子后160 bp处。从分析结果来看,GhDr1符合典型的真核生物基因结构。在转录起始位点上游—30bp和—70 bp处有TATA盒、CCAAT盒等启动子核心序列,将GhDr1的启动子区定位在5'—UTR区及转录起始位点上游大约1.5 kb的范围内。分析启动子区顺式作用元件发现GhDr1存在许多与逆境相关和信号转导相关的顺式调控元件。生物信息学分析GhDr1基因,结果表明:GhDr1的编码区全长1485 bp,编码494个氨基酸残基,为稳定的带负电酸性蛋白质;GhDr1蛋白二级结构中α螺旋占40.69%、延伸主链占10.12%、β—转角占4.25%、无规则卷曲占44.94%;三级结构预测主要由α螺旋和无规则卷曲构成的空间结构可能促成特定的氨基酸残基充分靠近以形成特定的催化活性中心等功能位点;亲疏水性和跨膜区预测发现在GhDr1的氨基酸序列中亲水性氨基酸较多,且存在集中的亲水区,没有明显的跨膜螺旋,为亲水性可溶蛋白;GhDr1没有明显的信号肽序列,亚细胞定位预测GhDr1定位于细胞质的可能性最大;同源性比对的结果表明GhDr1与蓖麻、葡萄、毛果杨和拟南芥的相关蛋白同源性最高。GhDr1与同源蛋白间进化树分析的结果符合这些物种间进化上的亲缘远近关系。功能域预测发现:GhDr1有24个潜在的磷酸化位点,推测GhDr1蛋白功能的发挥可能与激酶磷酸化有关;GhDr1存在N—糖基化位点、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、N—豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点等许多抗逆相关蛋白序列中存在的翻译后修饰位点;GhDr1含有Zinc finger,RING—type—like domain等锌指类功能相关模块,说明GhDr1可能属于一类较新的锌指类蛋白;ELM预测发现GhDr1含有MAPK相互作用识别位点和MAPK磷酸化位点,推测GhDr1参与MAPK信号转导路径的磷酸化级联反应;Map Viewer分析拟南芥和葡萄基因组上GhDr1同源基因所处基因簇上下游基因功能时发现许多参与植物逆境反应和信号转导途径的功能蛋白。通过生物信息学分析的结果预测GhDr1参与了棉花逆境反应信号转导途径,可能在信号转导途径的MAPK磷酸化级联反应中被调节。本研究不仅为了解棉花的详细抗逆分子机理提供了信息,也为通过基因工程的手段改良棉花的抗逆性状提供了基因源。

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