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变形链球菌CH43变链素Ⅰ基因片段的克隆、表达和抗链球菌作用的研究

石馨  倪龙兴  牛忠英  
【摘要】:目的:(1)获得编码变形链球菌CH43变链素Ⅰ前体肽基因片段(2)构建Ⅰ型变链素的原核表达载体,优化表达条件,纯化融合蛋白。(3)分析融合蛋白杀伤口腔3株链球菌的最小浓度。方法:(1)厌氧条件下培养变形链球菌CH43,通过碱裂解法得到其基因组DNA。利用PCR技术从变形链球菌CH43基因库中扩增出编码变链素Ⅰ前体肽mutA基因片段相应大小的DNA片段,将片段与pMD18-T载体连接后测序以检测序列正确性。(2)将测序正确的Ⅰ型变链素mutA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pProEX-HTb,将连接产物转化入E.coli DH-5α,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白.以IPTG浓度,A600值,诱导时间各梯度优化表达。(3)通过镍离子柱亲和层析,纯化诱导表达的融合蛋白,变复性处理后,分析融合蛋白抑制口腔三株链球菌的最小杀菌浓度。结果:(1)PCR获得的mutA序列与GenBank报道的一致(为147bp)。(2)Ⅰ型变链素的mutA基因片断被成功克隆入原核表达载体pProEX-HTb中,在A600达到1.000以上,IPTG终浓度1.2mM,30℃诱导 6hr,蛋白表达量较佳,稳定可重复。(3)诱导蛋白对3株口腔链球菌的最小杀菌浓度均为了1.25μg/mL。结论:成功克隆变形链球菌CH43变链素ⅠmutA基因片段,构建表达纯化了Ⅰ型变链素的融合蛋白,融合蛋白对3株口腔链球菌均有明显的抑制活性。

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