体内外构建软骨-骨再生理想微环境修复兔关节软骨及软骨下骨缺损的实验研究

【摘要】：[目的]针对目前组织工程软骨修复领域中新生组织缺乏软骨特性以及远期效果欠佳的现状,选取理想种子细胞与合适的双相复合型支架,通过体外体内构建理想微环境,进一步揭示材料与细胞、体内微环境相互作用的规律及机制,比较各种微环境下软骨-骨再生效果的差别,将研究成果指导临床实践,为临床治疗软骨疾病提供参考和理论依据。[方法]以聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)、纳米羟基磷灰石(Nano-hydroxyapatite,nHA)为原料制备由软骨相和骨相构成的三维支架,将制成的Ⅱ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅡ)涂于表面制成PLGA/ColⅡ-PLGA/nHA软骨-骨双相支架材料。取比格犬自体骨髓分离培养获得的第2代骨髓基质干细胞(BMSCs),分别进行普通三维培养以及特定低氧条件进行培养诱导,然后以1×10~6个/mL接种于双相支架,扫描电镜观察支架结构和细胞分布。比格犬60只,制作股骨远端负重关节面软骨及软骨下骨缺损模型,并随机分为4组,每组15只:A组拟用软骨下骨钻孔法依靠机体自身修复关节软骨及软骨下骨缺损;B组拟植入未接种干细胞的单纯双相支架材料修复;C组拟植入经自体外源性BMSC-支架复合物三维培养的组织工程软骨-骨复合体进行修复;D组拟植入联合三维及低氧条件培养的组织工程软骨-骨复合体物进行修复。于术后1、3、6、9个月取材行大体及组织学观察,术后9个月对各组标本行大体评分比较、Micro CT扫描定量分析及免疫组织化学染色观察。[结果]扫描电镜示双相支架孔隙连通性好,软骨相孔径100~200μm,骨相孔径300~500μm。BMSCs在双相支架内生长良好。大体观察示术后9个月内B组关节表面逐渐形成类软骨样组织,部分出现塌陷或不规则缺损;C、D组关节面无塌陷或碎裂,新生组织质地更接近正常组织;A组缺损一直存在。大体评分显示A、B、C组间修复效果比较差异均有统计学意义(P0.001),C组优于B组,A组最差。Micro CT扫描示B、C、D组软骨下骨得到良好的修复重建,定量分析示C、D组骨组织体积分数、结构模型指数及骨小梁数目均高于B组,但差异无统计学意义(P0.05)。组织学观察示术后1个月D、C、B组缺损区存在炎性反应;术后3个月新生组织长入;术后6个月支架完全降解,新生组织在植入物及缺损边缘爬行生长;术后9个月形成大量胶原纤维,缺损表面多为纤维软骨。A组观察期内缺损持续存在,术后9个月缺损区表面免疫组织化学ColⅡ染色示C、B组标本呈弱阳性,D组呈较强阳性。总体修复效果:D组优于C组,C组优于B组,A组最差。[结论]通过骨软骨组织工程方法,采用适宜的生物材料、理想的种子细胞,构建有良好生物相容性的细胞-双相支架复合物,为干细胞的生长、分化提供最近似于体内的微环境,一体化修复软骨及软骨下骨,是软骨修复的理想途径。