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绿原酸对氧化应激损伤内皮细胞的保护作用及机制探讨

卞合涛  黄卫  李士勇  
【摘要】:目的:缺血性脑卒中是临床常见疾病之一,死亡率和致残率均较高,遗留的神经功能障碍一直是困扰着神经科学的重大难题。脑组织发生缺血后可导致缺血区神经元的坏死,及时恢复缺血区血运是治疗脑缺血的关键。目前研究表明脑缺血后缺血区会有代偿性的血管新生,血管新生可以恢复缺血区的血供,同时还可以分泌神经营养因子,为缺血区营造一微环境,促进受损神经元功能的恢复。血管新生和微环境的营造主要靠缺血区周围的内皮细胞来实现,但脑缺血后会在其周围发生氧化应激反应,损伤内皮细胞,抑制了血管新生和神经营养因子的释放。近年来,有研究表明绿原酸具抗氧化作用,可有效的清除自由基,保护组织细胞免受氧化损伤。但绿原酸是否对内皮细胞具有抗氧化应激损伤作用及其可能机制尚待研究证实。本课题拟通过观察绿原酸对氧化应激损伤内皮细胞的保护作用及线粒体凋亡途径分子在该过程中的表达变化,探讨绿原酸对内皮细胞的抗凋亡作用及其可能机制,为将来临床上更好的利用绿原酸治疗缺血性脑卒中提供理论依据。方法:1.过氧化氢(H2O2)以浓度梯度和时间梯度作用于HUVECs,通过流式细胞仪测定细胞凋亡率,建立氧化应激损伤模型。2.实验分四组:正常对照组,绿原酸组,H2O2损伤组,绿原酸保护组;各实验组细胞分别给予相应处理12h后待检。3.流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡率。4.线粒体膜电位检测各实验组细胞凋亡情况。5.Hoechst33258荧光染色观察各实验组细胞凋亡情况。6.RT-PCR检测各实验组细胞的Bcl-2、Caspase-3的mRNA表达水平。7.Western blot检测各实验组细胞的Bcl-2、Caspase-3的蛋白表达水平。结果:1.H2O2以浓度和时间依赖性诱导HUVECs凋亡,建立氧化应激损伤模型适宜条件为400μM H2O2处理HUVECs12h。2.流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡率(%):正常对照组:5.18±2.13,绿原酸组:9.55±2.82,H2O2损伤组:66.78±9.71,绿原酸保护组:46.75±6.79。结果可见H2O2损伤组细胞凋亡率明显高于正常对照组(P0.05),绿原酸保护组细胞凋亡率明显低于H2O2损伤组(P0.05)。表明H2O2可诱导HUVECs凋亡,绿原酸具有明显的抗凋亡功能。3.细胞线粒体膜电位检测可见H2O2可诱导HUVECs凋亡,绿原酸具有明显的抗凋亡功能。4.Hoechst33258荧光染色可见H2O2可诱导HUVECs凋亡,绿原酸具有明显的抗凋亡功能。5.RT-PCR显示绿原酸保护组Bcl-2mRNA表达水平明显高于H2O2损伤组(P0.05),Caspase-3mRNA表达水平明显低于H2O2损伤组(P0.05)。表明绿原酸保护HUVECs时上调了Bcl-2基因的表达,下调了Caspase-3基因的表达。6.Western blot显示绿原酸保护组Bcl-2蛋白表达水平明显高于H2O2损伤组(P0.05),Caspase-3蛋白表达水平明显低于H2O2损伤组(P0.05)。表明绿原酸保护HUVECs时上调了Bcl-2蛋白的表达,下调了Caspase-3蛋白的表达。结论:1.H2O2以浓度和时间依赖性诱导HUVECs凋亡。2.绿原酸具有明显的抗氧化应激损伤保护HUVECs的作用。3.绿原酸保护HUVECs的机制可能与抑制细胞线粒体凋亡途径有关。

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