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一个与抗黄萎病和耐干旱、盐胁迫相关的棉花受体类似蛋白激酶基因的克隆与功能鉴定

赵君  丁林云  郭旺珍  张天真  
【摘要】:棉花作为世界性的重要经济作物,产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。然而随着环境恶化,棉花在其生长区域频繁遭受着干旱、高盐、低温等非生物以及病害等生物胁迫的侵袭,严重影响着棉花的生长发育和产量。陆地棉是我国棉花的主栽品种,占棉花栽培面积的95%以上,然而在这些主栽品种中,抗逆性好和品质优良的品种并不多,特别是抗黄萎病品种的培育,由于在陆地棉中找不到免疫或高抗的黄萎病抗源,所以抗黄萎病育种一直是育种家的一大难题。因此,通过研究棉花抗逆抗病机制,利用基因工程的方法来培育优良的棉花新品种将是今后棉花育种的主要方向。受体类似蛋白激酶属于蛋白激酶的一个亚家族,在拟南芥体内约有600多个成员,已经发现的激酶有BRI1,CLAVATA1,Pto,SRK和Xa21等。这些基因在植物自交不亲和,抗病,耐逆,发育调节,以及激素识别等方面发挥重要的作用,但是其中大多数激酶基因功能并不清楚。本研究中的受体类似蛋白激酶基因是从我国遗传研究和育种广泛利用的抗黄萎病品种海岛棉海7124(G.barbadenseL.cv.Hai7124)为材料克隆获得,基因ORF全长1080bp,编码360个氨基酸,没有内含子,与受体类似蛋白激酶高度同源,包含了受体类似蛋白激酶的11个保守结构域,所以我们将其命名为GbRLK。从两个二倍体棉花和四倍体海7124的At、Dt亚组的中分别获得了GbRLK基因序列,序列比对发现该基因在二倍体AA以及At亚组中与DD或Dt亚组相比缺失一个碱基,导致基因翻译提前终止。结合该基因受体类似蛋白激酶的保守域,可知在四倍体棉花海7124基因组中以受体类似蛋白激酶发挥作用的基因来源于Dt亚组,而At亚组的基因变成新基因或变成无效基因。用该基因的全长ORF与GFP融合,构建植物表达载体,通过转化洋葱表皮细胞,发现该基因定位于细胞膜上。RT-PCR和NorthernBoltting分析表明该基因受黄萎病菌诱导,在诱导后96h表达;同时该基因也受ABA、PEG、NaCl等非生物胁迫诱导表达,而与低温和涝害胁迫无关。结合该基因的定位及在胁迫处理后的表达结果,我们认为该基因可能与植物抗逆和抗病信号传导相关。为了进一步验证GbRLK基因的功能,用pBI121质粒载体构建了GbRLK的CaMV35S组成性表达启动子驱动的过量表达载体,用flower-dip的方法转化拟南芥Col-0,获得四个转基因纯合株系。Southern杂交分析表明,这四个转基因株系含有1-3个拷贝数。这些转GbRLK的拟南芥株系表现出ABA的敏感性,并且明显提高了对干旱、高盐和黄萎病菌的抗性。在含有不同浓度ABA的培养基上,转基因拟南芥的发芽率受到显著抑制,在含有100、200、400、800nmol/L的ABA培养基上生长7d后调查拟南芥的发芽率,非转基因拟南芥的发芽率分别为92.73%,86.59%,80.41%,68.19%;而转基因株系敏感性最差的K6发芽率分别为88.36%,78.66%,56.25%和27.08%,表现敏感性最强烈的是K2,其发芽率分别是76.24%,68.14%,18.35%,2.17%;在含有不同浓度的甘露醇和氯化钠培养基上生长6周后,转基因拟南芥的存活率显著高于非转基因对照,在含有100mM氯化钠的培养基上生长6周后,转基因拟南芥K2,K3,K5和K6的存活率分别为62.9%,43.9%,45.8%和37.5%,而非转基因对照的存活率只有22.9%;在含有500mM和750mM的甘露醇培养基上,转基因拟南芥存活率最低的克隆K6的存活率为51.3%和38.3%,而非转基因对照的存活率分别为33.1%和21.1%。将转基因和非转基因拟南芥对照的离体叶片放置在相同的环境中,60min后转基因拟南芥K2,K3,K5和K6的失水率分别为15.9%、19.2%、17.9%和20.8%,而非转基因对照的失水率达到24.1%,达到差异显著水平;其中失水率在120min时差异开始增大;在360min后,转基因拟南芥的失水率最高的克隆为K6(64.2%),而非转基因对照失水率为81.9%。在接种落叶型菌株VD8和非落叶型菌株Bp2后,转基因拟南芥都表现出抗性,在接种病菌4周后,抗性最差的转基因拟南芥克隆K6的鲜重为0.44g,花青素积累量为17.34nmol/g,叶绿素含量为0.74nmol/g,叶片失绿症状为2.0,发病率为80%;而非转基因对照的各种指标值分别为0.24g,28.88nmol/g,0.49nmol/g,3.0和93.4%,达到显著差异水平;同时,我们使用qRT-PCR的方法,拟南芥Rubisco基因为内参,设计特异扩增黄萎病菌基因组序列的引物,以接菌后拟南芥地上部分为试验材料,定量检测接菌后14d定殖在拟南芥体内的黄萎病菌生物量,发现转基因拟南芥抑制黄萎病菌在体内的扩散。为了揭示该基因提高转基因拟南芥对胁迫的抗性机理,我们用高通量的新一代测序方法研究了转基因和非转基因拟南芥的基因表达谱。供试材料分别是转基因的两个克隆纯系K6和K2(抗性存在差异)以及非转基因受体Col-0。结果分析发现,外源GbRLK基因的导入促使转基因拟南芥一系列基因表达量发生变化。转基因株系K2和K6与非转基因对照比较,发现了809个差异表达基因,其中转基因植株上调的有347个,转基因植株下调的462个。在上调的347个基因中,有18个基因是转基因拟南芥在接菌前特异表达的基因,其中包括6个是转录因子,分别是bHLH100、bHLH038、bHLH101、bHLH039、RRTF1和CBF2。在上调的差异基因中,包括DNA结合蛋白,转录因子,电子传递链,碳水化合物转运,磷酸化以及金属离子或阳离子结合转移过程等,其中DNA结合蛋白和转录因子类所占比重最高,达到约10%。在这些上调的基因中,包括了许多与胁迫相关的基因,但是很少有与已经证明在植物抗病反应中起关键作用的基因,这证明该基因可能主要参与ABA信号调节的生物和非生物胁迫反应。这一结果为深入研究GhRLK基因抗病机理及构建植物抗病信号基因网络奠定了基础。为了进一步研究该基因的表达调控机制,用Sefa-PCR的方法,获得该基因5’上游约3,200bp的启动子序列。采用PlantCARE和PLACE等生物信息学分析软件对启动子区中潜在的顺式调控元件进行预测,我们发现该区域包含许多逆境响应的顺式作用反应元件,如ABRE,W-Box,MYB-core,W-Boxcore和TCA-element等。根据分析结果,我们构建了三个基因5’上游不同缺失长度的表达载体用于转化拟南芥,通过GUS组织活性染色发现,该基因主要在植物的根、叶脉以及导管中表达,在植物的气孔中有微弱表达。转基因后代在ABA、PEG、NaCl和黄萎病菌处理后,GUS活性显著升高。根据5’缺失序列分析结果表明,包含了ABRE,MYB-core和W-Boxcore元件的-1/-664bp的启动子区域有效介导了启动子的ABA、PEG、NaCl和黄萎病菌等胁迫诱导的响应过程;在-665/-1,475bp处存在对病菌胁迫有增强效果的反应元件,而在-1,475/-1,890bp处包含启动子的负调控元件。上述结果也证明了GbRLK基因在植物胁迫反应过程中起关键的作用。此外,我们将GbRLK基因导入棉花受体W0品系中,对获得的四个转基因纯合株系进行抗病性鉴定,结果表明转基因棉花在接种黄萎病菌前期并没有表现出对黄萎病菌的抗性,而在后期的调查中发现转基因棉花对黄萎病菌的抗性显著提高。这一结果证明GbRLK基因可能是通过降低植株因水分缺失带来的伤害而到达抗病的目的。

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