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结核特异性血清标志物的筛选研究

杨华  刘忠华  杨焕森  王洁  沙巍  胡忠义  
【摘要】:目的利用纯化的结核病人血清IgG从噬菌体展示随机七肽文库中筛选结核特异性血清标志物,为下一步开发新的结核病血清学检测试剂提供思路。方法以纯化后结核病人血清IgG作为固相配基,按吸附、洗脱、扩增的淘洗过程对噬菌体展示随机七肽文库进行筛选,并于第2至3轮的筛选中加入纯化后健康人血清IgG进行反筛,经3轮生物淘选后,分别随机选取结核病人IgG和健康人IgG洗脱单噬菌体各20个进行扩增纯化,提取单链DNA作为模板进行测序,间接ELISA法检测不同单噬菌体与结核病人和健康人IgG的结合情况,鉴定出阳性克隆。选取38份活动性肺结核患者和37份有卡介苗接种史健康人的血清标本,采用phage-ELISA法对获得的阳性单噬菌体进行初步验证。结果通过3轮生物淘选,能与靶分子特异性结合的噬菌体得到明显富集。单噬菌体测序分析共获得12种共同序列,其中WHKEQFW序列为结核病人IgG筛选单噬菌体的优势序列,而健康人IgG洗脱噬菌体中则以NTWHNSR序列为优势。12种序列各取1个克隆扩增后进行间接ELISA检测,结果表明单噬菌体H12与结核病人IgG具有较高的亲和力(S/N≥2.1),确定为阳性克隆。间接ELISA检测发现,单噬菌体H12对结核患者血清标本检出的A450值明显高于对健康人的检出值,P0.0001,具有统计学意义。结论利用噬菌体展示随机肽库技术淘选获得了结核特异性血清标志物,显示出与结核病人IgG较特异的结合活性,阳性单噬菌体对结核患者与健康人血清的检出值具有显著性差异,为以多肽为基础探索新的结核病血清学诊断方法提供依据。

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