一株纤维素酶产生菌外切纤维素酶基因的克隆及在巴斯德毕赤酵母中的表达

【摘要】：纤维素是地球上最为丰富的可再生性资源,占地球生物总量的40%,是目前分布最广的天然碳水化合物,每年全球年产量高达4000亿吨。但是这些资源绝大部分目前都没有得到很好的利用。随着石油和煤炭资源的日渐枯竭,酶法降解和利用纤维素以其特异性高,反应条件温和,环境污染小等优点越来越受到人们的重视。纤维素酶是能够降解纤维素的一类酶的总称。包括外切葡聚糖酶(C1酶,来自真菌的简称CBH)、内切葡聚糖酶(Cx酶,来自真菌中的简称EG)和葡萄糖苷酶(简称BG),纤维素的完全降解需要3类酶的协同作用。C1酶是对纤维素最初作用的酶,它作用于纤维素线状分子末端,破坏纤维素链的结晶结构。即C1酶是作用于不溶性的固体表面,使形成结晶结构的纤维素链开裂,水解β-1,4一糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子,从非还原性长链分子的末端部分游离出葡萄糖,从而使得纤维素链易于水化。外切葡聚糖酶是木霉的主要纤维素霉,包括CBHⅠ和CBHⅡ两种。CBHⅠ的产量很高,约占外分泌蛋白总量的60%,它和底物的亲和性较高,但活性较低。CBHⅡ所占比例比CBH工少,但特异性强酶活力高,CBHⅡ降解微晶纤维素产生还原糖的能力比CBHⅠ高2倍。对实验室分离到的一株产纤维素酶的丝状真菌进行18S和ITS鉴定,表明其为长梗木霉。用TRIZOL法提取该菌的总RNA,参照里氏木霉基因序列设计外切纤维素酶基因引物,通过RT-PCR得到该菌的外切纤维素酶CBHⅠ和CBHⅡ的全长和成熟肽基因,测序结果表明,CBHⅠ全长和成熟肽基因分别为1545bp和1491bp;CBHⅡ全长和成熟肽基因分别为1413bp和1341bp。将全长和成熟肽基因分别连接到Ppic3.5K和Ppic9K上,转化巴斯德毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达后离心取上清液,以PNPC为底物测定外切纤维素酶活力。实验结果表明发酵上清液具有外切纤维素酶活力,表达成功。