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耐有机溶剂蛋白酶产生菌PT121基因的克隆及异源表达

何小丹  李秀婷  吴光耀  何冰芳  
【摘要】:蛋白酶催化的最普通的反应是水解蛋白质中的肽键,而在有机相中能进行水解的逆反应,可表现为酰胺酶活力或酯酶活力。利用蛋白酶在有机相中合成肽的衍生物,不仅使得底物中的氨基酸部分侧链不需保护,而且避免了在化学法合成中存在的产物消旋问题,还可增加非极性底物的溶解度,减少副反应。有机相体系的催化还有利于酶与产品的分离及酶的再利用,增加酶的热稳定性,减少微生物污染的可能性等。由于蛋白酶对细胞的天然毒性以及蛋白酶基因的前肽及信号肽基因结构的影响,利用基因工程手段高效表达耐有机溶剂蛋白酶存在着一些技术及表达策略上的瓶颈。本研究根据已筛选并纯化的产耐有机溶剂蛋白酶菌株pseudomonas aeruginosa PT121蛋白酶分子量的大小,并参考Genebank中报道的pseudomonas aeruginosa K的蛋白酶基因序列(Accession number:EU021222)设计引物,通过TD-PCR反应体系和条件的优化成功克隆了PT121耐有机溶剂弹性蛋白酶基因lasB。经测序表明,该蛋白酶基因序列与EU021222基因序列相似度达99%。首先将lasB基因的CDS(包括信号肽、前肽和成熟蛋白区)插入到原核表达载体pET-22b中,在大肠杆菌BL21中诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,得到了与目的基因大小相对的蛋白条带,但未检测到活性,可能是由于其信号肽及前肽在大肠杆菌BL21中未被剪切,而在胞内形成了没有活性的前蛋白。另将lasB基因的成熟蛋白区基因构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pUBC19中,此穿梭质粒带有B.sbtilis168的强启动子p43和其自身蛋白酶基因nprB的信号肽。将构建好的质粒p43NLB导入到敲除了8个胞外蛋白酶基因的枯草芽胞杆菌WB800,阳性克隆子在牛奶板上能产生水解圈,选择透明圈较大的单菌落发酵140h左右,酶活达到80U/mL左右,实现了蛋白酶在枯草芽胞杆菌表达系统中的分泌表达。

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