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猪Gasdermin D蛋白的剪切——caspase-1的角色

张文龙  宋悦阳  宋佳梦  王萌  
【摘要】:人类和小鼠的Gasdermin D (GSDMD)蛋白是细胞焦亡事件的直接执行者之一,但是关于猪GSDMD蛋白表达及活化的研究很少。本研究首先分别制备了猪GSDMD和caspase-1的特异性多克隆和单克隆抗体,并利用制备的特异性抗体证明了产肠毒素大肠杆菌接种的仔猪肠道中发生了caspase-1的活化以及GSDMD分子的剪切。为了进一步阐明猪caspase-1活化与GSDMD剪切之间的关系,本研究分别构建了猪caspase-1和GSDMD的原核和真核表达质粒。利用大肠杆菌表达的重组猪caspase-1和GSDMD进行了非细胞环境切割实验;利用真核表达质粒转染HEK293细胞,进行了细胞内切割实验。结果表明,猪caspase-1能够剪切GSDMD。VX-765 (caspase-1抑制剂)和Z-VAD-FMK (泛caspase抑制剂)能够抑制上述实验中猪caspase-1对GSDMD的剪切。将猪GSDMD第279位的天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A),能够完全抑制caspase-1对GSDMD的剪切。猪GSDMD氨基端节段转染真核细胞能够导致细胞LDH释放量显著上升,说明其对真核细胞细胞膜具有损伤能力;猪GSDMD氨基端节段在大肠杆菌中表达时,能够显著杀伤重组大肠杆菌。另外,本研究还证实,猪caspase-3能够切割猪GSDMD,产生一个大小约为43kDa的节段。综上所述,本研究证实了,猪GSDMD可以被caspase-1切割,切割位点为D279与G280之间;切割产物中的GSDMD氨基端节段具有损伤真核细胞细胞膜结构和杀伤大肠杆菌的能力。

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