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结核杆菌ESAT6蛋白的原核表达与纯化

王英  薛玉芹  陈勇  唐洁  王雪梅  方强  
【摘要】:研究背景:结核病是由结核分支杆菌引起的一种人兽共患传染病,随着流动人口剧增、结核菌与艾滋病毒双重感染和多重耐药结核菌病的挑战均增加了结核病防治工作的难度,使严重的结核病疫情更加复杂。卡介苗对儿童的保护力很好,而对成人的保护效率则存在很大差异。因此,发展安全、高效的新型疫苗迫在眉睫。ESAT6蛋白是从结核分枝杆菌短期培养滤液中纯化的一种分泌性蛋白,能刺激机体产生保护性免疫反应,仅存在于致病性分支杆菌而卡介苗等非致病分支杆菌缺乏。许多研究表明,ESAT6蛋白可作为亚单位疫苗的组分以及成为DNA疫苗的候选抗原,而达到长期、有效的预防结核病的目的。目的:原核表达并纯化结核分枝杆菌ESAT6重组蛋白。方法:从结核杆菌H37 Ra菌株中提取DNA,以此为模板PCR扩增ESAT6基因,双酶切后克隆入表达载体p ET42a(+)中,构建原核重组质粒PET42a(+)-ESAT6,将其转化入大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,用含卡那霉素的培养液过夜增菌,收集宿主菌并提取质粒,用双酶切和DNA测序鉴定。之后再转入大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选阳性菌。阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析ESAT6蛋白的表达;之后用GST和Ni-NTA柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blotting对目的蛋白进行分析和鉴定。结果:PCR扩增出目的片段近300bp;重组质粒经PCR、双酶切验证与预期结果一致,测序与Gen Bank中结核杆菌ESAT6基因序列一致。经37℃、1mmol/l IPTG诱导6h,SDS-PAGE分析显示p ET42a(+)-ESAT6表达出3KDa左右的重组蛋白且以可溶性和包涵体的形式存在,调整诱导条件;30℃、0.4mmol/l IPTG诱导7h显示可溶性蛋白有所提高占总菌体蛋白的23%,经GST和Ni-NTA柱后获得纯化的重组蛋白。Western-blotting结果显示目的蛋白可被结核病人血清所识别。结论:成功构建了原核表达载体p ET42a(+)-ESAT6,并原核表达了重组ESAT6蛋白。

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