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模拟微重力对人牙髓干细胞生物学性状的影响

潘爽  何丽娜  吴相周  王田田  牛玉梅  
【摘要】:目的:探讨模拟微重力(simulated microgravity,SMG)对人牙髓干细胞(human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs)生物学性状的影响及其机制。方法:原代培养并鉴定人牙髓干细胞,将第3代人牙髓干细胞接种于聚乙醇酸-聚羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)三维支架上,分别在模拟微重力环境下(实验组)和普通环境下(对照组)培养72小时。1.采用MTT法检测普通环境和模拟微重力环境中hDPSCs在PLGA支架上的细胞活性;流式细胞术及Western Blot检测hDPSCs在PLGA支架上培养72小时后的细胞周期分布及细胞周期蛋白Cyclin A,Cyclin E、细胞周期依赖性激酶Cdk2、细胞周期依赖性激酶抑制因子p21和p27的蛋白表达变化。2.采用免疫荧光法观察hDPSCs细胞骨架变化;3.采用Transwll法检测实验组和对照组细胞迁移能力变化。4.采用黏附实验、DAPI荧光染色以及real time PCR array检测细胞黏附能力以及84种细胞外基质及黏附分子mRNA的变化。5.行Realtime-PCR检测LARG基因的mRNA相对定量表达;拖拽实验检测RhoA-GTP表达情况;western blot检测RhoA及下游信号分子LIMK-P蛋白表达情况,探讨参与细胞骨架及迁移能力变化的信号通路。6.将实验组和对照组分别植入裸鼠皮下,4周后取出组织块,行HE染色、Masson三色染色、Ⅰ型胶原和ki67的免疫组化染色。结果:1.MTT显示模拟微重力组的OD值均高于普通环境培养组;细胞周期分析结果表明模拟微重力组中S期细胞比例明显高于普通环境培养组,且大部分细胞处于G1期;模拟微重力组中Cyclin A,Cyclin E和Cdk2蛋白表达水平升高,p21和p27的蛋白表达水平降低。2.4h时即有粗大的微丝纤维束解聚,24~72h变得模糊,紊乱,且出现多向排列趋势。3.实验组细胞迁移数量少于对照组。4.细胞黏附实验和DAPI荧光染色发现,模拟微重力组中黏附在纤连蛋白包被的皿底和黏附在PLGA支架上的细胞数量都明显比普通环境组多;real time PCR array结果显示模拟微重力下84种细胞外基质及黏附分子中有5种基因(ITGA6,ITGAV,ITGB1,LAMB1,TNC)上调。5.模拟微重力条件下培养的hDPSCs细胞LARG基因的mRNA表达下调;RhoA,RhoAGTP及LIMK-P蛋白下调。6.HE染色可见实验组平均细胞数明显多于对照组;Masson染色观察实验组胶原纤维,分布较均匀且广泛;ki67及Ⅰ型胶原免疫组化结果显示实验组阳性率明显高于对照组。结论:模拟微重力可能通过改变细胞周期进程、整合蛋白的表达而促进人牙髓干细胞的增殖与黏附能力;其对人牙髓干细胞细胞骨架重排及迁移能力的改变可能通过RhoA/ROCK信号通路实现。

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