放线菌素D所致V79细胞凋亡模型的建立

【摘要】：目的用RNA合成抑制剂——放线菌素D(ActD)作用于V79细胞不同剂量和时间,筛选出最适作用浓度和时间以建立稳定的V79细胞凋亡模型。为后续研究旁观者效应提供实验基础资料。方法不同剂量(0,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0mg/L)放线菌素D培养V79细胞不同时间(0.5,1,2,4h)。相差显微镜观察细胞形态学改变;MTT法测细胞存活率;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死率水平,并确定最适放线菌素D作用浓度和时间;染色体畸变分析检测染色体损伤;Hoechst33258染色,Annexin V-FITC/PI双染,荧光显微镜下观察凋亡情况;透射电子显微镜观察细胞超微结构的影响。结果细胞形态学观察发现对照组细胞正常,呈梭形、多角形。随剂量增加(0.5～4mg/L)变形细胞增多,细胞变圆、脱落,有发泡现象。8mg/L组,细胞溶解、消失,死亡细胞过多。细胞存活率随着ActD剂量的增加而下降,存在明显的剂量-效应关系(P0.05)。在0.5～4mg/L之间,剂量与存活率存在稳定的剂量-效应关系,基本呈线性。随着时间的延后,存活率均有下降的趋势,4h时最低。不同剂量(0.25、0.5、1、2、4mg/L),不同作用时间(0.5h、1h、2h、4h)细胞凋亡率高于对照组(3.04±0.02)%,0.5h各剂量组分别为:(5.95±0.03)%,(9.06±0.19)%,(27.91±1.32)%,(35.75±2.98)%,(69.70±4.76)%;1h分别为:(8.51±0.07)%,(37.39±2.61)%,(68.14±4.23)%,(72.68±5.44)%,(77.10±4.05)%;2h分别为:(10.88±0.11)%,(32.53±2.05)%,(61.97±4.83)%,(69.19±3.21)%,(69.41±4.29)%;4h分别为:(17.48±1.24)%,(37.67±2.78)%,(47.97±4.53)%,(46.67±3.89)%,(43.44±2.95)%。细胞凋亡率随剂量增加而增加,4mg/L最高且稳定。作用1h时凋亡率达到最高,而坏死率4h最高。染色体畸变分析表明ActD可以引起V79细胞的染色体畸变,类型以断裂为主,伴有少量的环状染色体,双着丝粒染色体。荧光染色证实了在该剂量作用下细胞死亡以凋亡为主。透射电镜下细胞出现明显凋亡特征,细胞皱缩,染色质成团块状改变。结论ActD可致V79细胞染色体损伤,是一种V79细胞的化学诱变剂。用ActD建立V79细胞凋亡模型最适剂量和时间为:4mg/L作用1h。