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RNA干扰对食管癌细胞CHK1和CHK2表达以及照射后细胞周期的影响

祝淑钗  刘志坤  王玉祥  杨洁  苏景伟  李娟  沈文斌  
【摘要】:目的观察采用RNA干扰技术降低食管癌细胞中基因MDC1和53BP1的蛋白表达后,对DNA损伤信号通路中下游周期调节蛋白CHK1和CHK2的蛋白表达和细胞核内MDC1和53BP1斑点形成以及照射后细胞周期改变的影响。方法①采用MTT法和克隆形成实验分别检测了ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B食管癌细胞之间细胞增殖和放射敏感性之间的差别;②采用流式细胞技术检测5Gy的放射线照射后1h、2h、12h、24h和48h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B细胞周期和凋亡的变化;③采用western blotting检测CHK1和CHK2蛋白表达、激光共聚焦显微镜检测细胞核内MDC1和53BP1斑点形成的变化。结果①MDC1和53BP1转染对食管癌细胞ECA109的增殖没有明显影响(P0.05)。②照射后1~2h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B细胞G0/G1期、G2/M期和S期的百分率没有明显变化。照射后12h,ECA109、ECA109- N、ECA109-M及ECA109-B细胞的G_0/G_1期的百分率均较未照射组降低(P0.05),而且受照射后,ECA109、ECA109-N组细胞的G_0/G_1期比例下降比ECA109-M及ECA109-B细胞明显(P0.05),细胞未受照射时, ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B组之间细胞G2/M期的比例没有明显差异(P0.05),当细胞受照射后,ECA109-M及ECA109-B组细胞G2/M期的比例明显低于ECA109、ECA109-N组(P0.05),ECA109-M及ECA109-B组细胞S期的比例明显高于ECA109、ECA109-N组(P0.05),各组细胞之间的凋亡变化没有明显的差别(P0.05);细胞受照射后24h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B细胞的G0/G1期的百分率均较未照射组下降(P0.05),ECA109、ECA109- N组细胞的G0/G1期比例下降比ECA109-M及ECA109-B细胞明显(P0.05);细胞未受照射时,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B组之间细胞G2/M期的比例没有明显差异(P0.05),当细胞受照射后, ECA109-M及ECA109-B组细胞G2/M期的比例明显低于ECA109、ECA109-N组(P0.05);各组细胞之间的S期和凋亡的变化没有明显的差别(P0.05);细胞受照射后48h,ECA109、ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B未照射组以及ECA109-M、ECA109-B照射组之间细胞G_0/G_1期的百分率无明显变化(P0.05),但高于ECA109、ECA109-N照射组细胞的G_0/G_1期百分率(P0.05);细胞未受照射时,ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B组之间细胞G2/M期的比例没有明显差异(P0.05),ECA109、ECA109-N、ECA109-M及ECA109-B照射组细胞的G2/M期的百分率高于未照射组(P0.05),而ECA109-M及ECA109-B组细胞G2/M期的比例低于ECA109、ECA109-N组(P0.05);各组细胞之间的S期的变化没有明显的差别(P0.05);ECA109、ECA109-N照射组细胞的凋亡率高于ECA109-M、ECA109-B照射组及未照射组细胞的凋亡率,差别具有统计学意义(P0.05)。③克隆形成实验结果显示ECA109细胞的的接种效率为64.8%,ECA109细胞的D_0值为3.06Gy,SF2值为0.91;ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B细胞的的D_0值分别为2.90Gy、1.88 Gy、2.07 Gy;SF2值分别为0.89、0.84、0.79,ECA109-M、ECA109-B细胞的放射敏感性高于ECA109-N、ECA109(P0.05)。④5Gy照射后1、2h、12h、24h和48h,ECA109、ECA109-N、ECA109 -M、ECA109-B食管癌细胞中CHK1、CHK2的蛋白表达变化未见明显变化(P0.05);在细胞受照射后1~24h, ECA109-M、ECA109-B组的CHK2T68蛋白表达低于ECA109、ECA109-N组(P0.05),而在照射后48h, ECA109、ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B之间的CHK2T68蛋白表达无明显差异(P0.05)。⑤ECA109、ECA109-N、ECA109-M、ECA109-B食管癌细胞接受4Gy放射线照射后1h,ECA109-M、ECA109-B组中的MDC1、53BP1核内斑点的数量明显减少且与对照组比较差别具有统计学意义(P0.05)。结论食管癌细胞ECA109-M、ECA109-B的放射敏感性高于ECA109-N、ECA109,提示转染对ECA109细胞具有放射增敏作用;5Gy照射后12小时以后,食管癌细胞ECA109-M、ECA109-B的G2期阻滞明显消除;ECA109-M、ECA109-B细胞接受5Gy放射线照射后,对下游蛋白CHK1和CHK2表达没有明显影响,但对CHK2-T68磷酸化水平具有明显抑制作用,而且细胞核内MDC1和53BP1斑点的形成明显减少。

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