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亮氨酸拉链结构蛋白基因的合成及其表达

何冬兰  Keisuke Makino  
【摘要】:酵母转录因子GCN4是通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质之一,当GCN4二聚体与DNA结合时,亮氨酸拉链区的两个单体结合为平行的卷曲螺旋结构,而其基区由无规线团结构变为α螺旋.为探讨亮氨酸拉链蛋白与DNA的结合机理,我们设计了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA的必需的35个氨基酸的折叠片段,并将其克隆到Escherichia coli BL21表达,本研究将讨论此亮氨酸拉链蛋白的基因合成、克隆及其表达条件。以ZF1(+)、ZF1(-)、ZF2(+)、ZF2(-)、ZF3(+)、ZF3(-)寡聚核苷酸片段在PCR自动热循环系统连接得到亮氨酸拉链蛋白基因片段,将此片段克隆到pBLZ和pET3b质粒中,酶切后用2%琼脂糖电泳检测证明克隆成功,将这2种重组质粒转化到E.coli DH5 α,发现pBLZ重组体在E.coli DH5 α中不能表达,而pET3b重组体在E.coli DH5 α中表达成功,从转化子中分离得到重组质粒DET3b,序列分析证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因;将重组质粒pET3b在E..coli BL21于5ml含有50μg/m氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中以IPTG为诱导剂,37℃下表达,10%SDS-PAGE检测到外源基因蛋白质分子量为4000Da左右;大量表达在10L含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中进行,结果发现37℃不能诱导表达,而在28℃时能大量表达。

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