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Sec61 α在肝细胞脂肪变性模型中的表达及可能作用机制

王军  熊吉  王涛  赖殊婕  王万东  陈东风  
【摘要】:背景:Sec61蛋白是内质网上重要的通道蛋白,也是未折叠蛋白转运及后续的未折叠蛋白降解途径(ERAD)的核心结构,对内质网应激(ERS)的平衡,维持ER复杂功能起着重要作用。它包括α、β、Y亚基,α亚基形成整个通道的核心。其主要功能是形成疏水通道,使核糖体合成的新生多肽通过并穿过内质网的内腔,完成正确折叠。作为一种通道蛋白,Sec61是否在肝细胞脂肪变性模型中发生了变化,是否参与肝细胞脂肪变性的过程,目前尚未见报道。目的:探讨非酒精性脂肪性肝病肝细胞体外模型中Sec61α的表达变化及可能作用机制。研究方法:应用软脂酸与油酸混合物(PA:0A=1:2)诱导L02肝细胞发生肝细胞脂肪变性,建立非酒精性脂肪性肝病肝细胞脂肪变体外模型,分为正常对照组与脂肪变性组,分别于0h、2h、4h、8h及16h收获细胞。采用油红0染色显示肝细胞胞质内脂滴情况,利用相差倒置显微镜观察其脂肪变化程度;每组肝细胞随机选取5个视野进行采图,并应用Image J软件进行图像分析,以平均脂变面积评价肝细胞脂变程度。根据L02细胞脂肪变性过程中,是否加入Sec61抑制剂EeyarestatinⅠ,将细胞分为正常对照组、脂肪变性组、Sec61抑制剂组及DMSO组。利用qRT-PCR及Western blot检测各时相点Sec61α、GRP78、GRP94及Bcl-2的表达变化。结果:软脂酸与油酸混合物成功诱导肝细胞发生脂肪变性。与对照细胞相比,脂肪变肝细胞Sec61αmRNA相对表达量在脂肪变早期下降(2 h、4 h,P0.05),晚期升高(8 h、12 h,P0.05);GRP78在8 h开始升高,16 h达到高峰(P0.01)。Sec61α与GRP78的蛋白水平与mRNA水平表达在时间梯度上变化一致。EeyarestatinⅠ处理显著减轻肝细胞脂肪变程度;与脂肪变性组相比,抑制剂组肝细胞Sec61α、GRP78明显降低(P0.01),GRP94、Bcl-2则显著升高(P0.01)。结论:内质网应激贯穿于肝细胞脂肪变的整个过程,随时间延长,ERS逐渐加重。内质网孔道蛋白Sec61在肝细胞脂肪变性过程中的早期(2 h,4h)先下降,此时ERS虽有发生,但程度较轻,Sec61的变化可能是一种适应性变化。在肝细胞脂肪变后期(8 h,12 h,16 h),Sec61随ERS进一步加重,表达逐渐升高。在加入Sec61抑制剂后,ERS明显减轻,肝细胞脂肪变性程度同步减轻,提示在肝细胞脂肪变性过程中,Sec61α可能通过调节内质网GRP78蛋白介导ERS系列反应,参与肝细胞脂肪变的发生发展。GRP94与Bcl-2应用Sec61抑制剂后,在抑制剂组表达较脂肪变性组明显升高,提示在肝细胞脂肪变性过程中,其可能通过调节肝细胞内Ca~(2+)浓度变化,参与ERS,从而影响肝细胞脂肪变的进展。

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