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慢病毒介导NEP1-40转染神经干细胞的研究

宋跃明  袁海峰  刘浩  龚全  孔清泉  周春光  
【摘要】:目的:在体外分离、培养、鉴定后获得神经干细胞,通过慢病毒载体将NEP1—40基因转入神经干细胞内表达。探讨NEP1—40基因体外转染大鼠神经干细胞以应用于基因治疗的可行性。方法:从孕18d的大鼠胚胎脑皮质中分离h获得脑源性神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代,并用20%的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用免疫荧光染色方法行Nestin、Tublin、GFAP及MBP免疫荧光染色,对NSC及其分化的细胞进行细胞类型鉴定。将传第三代的神经干细胞采用已成功构建的NEP1—40慢病毒载体转染,同时设立空白病毒对照及神经干细胞对照组。用荧光显微镜观察细胞内荧光表达情况,采用RT—PCR及Westernblot法检测NEP1—40在细胞内表达情况。结果:1、体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,该细胞具有连续增殖的能力,免疫荧光鉴定为Nestin染色阳性细胞;传代培养8代后仍具干细胞特性;2、取第3代神经干细胞球,采用神经小球分散试剂盒将其分散成单个悬浮细胞,将其培养于大鼠神经分化培养基内,倒置相差显微镜观察,7d后,细胞几乎完全分化。可见基本表现为一个或两个长突起、胞体呈圆形或椭圆形的神经元样细胞和具有多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞,;突起较少并且核呈现阳性染色的少突胶质细胞,免疫细胞化学染色细胞分别呈Tublin、GFAP、MBP阳性表达。3、经NEP1—40基因慢病毒载体转染后,当MOI值为0时,即无病毒感染的实验对照组,相同培养条件下均未见明显的绿色荧光。MOI值为5、10、15时,分别在24h、48h、72h时计算各组感染率,结果表明各组之间感染率有明显差异(P0.05)(图2—9),感染复数(MOI)为10,最佳感染率可达96%;4、GFP荧光表达24小时开始出现,48小时达最高分值,并且可以稳定表达。RT—PCR提示NEP1—40基因在实验组明显增加,West-ernblot结果提示NEP1—40及GFP融合蛋白在细胞内稳定表达。结论采用神经球悬浮培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NSC。该细胞在体外适宜的条件下能够大量增殖,并具有多向分化潜能。经慢病毒携带NEP1—40基因成功转染入神经干细胞内,并且可在神经干细胞内稳定表达。

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