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兔脂肪干细胞体外分离与培养

张强  罗庆  甘立强  傅跃先  
【摘要】:目的建立兔脂肪干细胞(ADSCs)体外分离培养的方法,为骨组织工程提供种子细胞。方法选用兔龄4个月雌性新西兰大白兔,采用无菌手术切取兔颈背部皮下脂肪组织,在无菌操作台内剪碎,用Ⅰ型胶原酶消化,经过洗涤、过滤、离心等步骤获取细胞。采用含体积分数0.1胎牛血清的DMFM/F12的培养液体外培养细胞,24h后首次换液,以后2~3d换液1次,1:2或1:3传代,以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化贴壁细胞传代。用倒置显微镜观察不同时期兔脂肪干细胞的形态特征,并用MTT法绘制细胞生长曲线。结果(1) ADSCs原代培养:初分离细胞呈圆形,折光性强,大小不一,接种24h左右开始贴壁;3d后细胞呈梭形或多角状,类似成纤维细胞;5d后呈团簇状生长,形成集落;约7d后细胞融合超过90%,细胞呈漩涡状排列。随培养时间延长不及时传代,部分细胞内积聚脂肪颗粒,细胞逐渐变为椭圆形,2周左右分化为多脂滴脂肪细胞。(2)ADSCs传代培养:细胞传代后,2~4h开始贴壁,细胞呈成纤维细胞样或多角形生长,均匀分布大小一致,细胞紧密排列,呈漩涡状生长,3d左右达90%融合,传代后的细胞长时间观察不到脂肪颗粒沉积而保持梭形,不能自发向脂肪细胞分化。11代细胞传代后细胞增殖速度逐渐减慢,集落簇团现象不如以前明显,显示细胞出现衰老征象。(3)ADSCs生长曲线及倍增时间:传代的AD- SCs生长曲线呈"S"形,接种后前3d为滞留期,3d后为对数生长期,在8d后进入生长抑制期,进入平台期,数目不在增长;群体倍增时间大约为55h。结论ADSCs来源广、易获取、对机体创伤小,经体外诱导后可实现成骨分化,是骨组织工程中一种新的种子细胞。本实验采用胶原酶消化法分离出的AD- SCs在体外生长旺盛,扩增迅速,长期传代仍能保持稳定的增殖能力。

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