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生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的优化

沈凤英  何丽明  刘大群  李亚宁  
【摘要】:玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌、瓜类白粉病菌等多种重要的植物病原菌具有较强的抑制作用,有良好的生防应用潜力。本文分别以基因整合型质粒 pSET152和基因破坏型质粒 pKC1139为出发质粒,以 ET12567(PUZ8002,pSET152)和 ET12567(PUZ8002,pKC1139)为供体,Men-myco-93-63孢子和菌丝体为受体,分别选取 MS、PDA、TSB 琼脂培养基、燕麦培养基为培养基进行接合转移试验。结果表明: 以孢子为受体时,孢子预萌发条件为50℃热激10 min,37℃温育2.5 h 在 MS 培养基上的转化效率是 10~(-7)~10~(-6),在其他培养基上接合转移子少或得不到接合子;以菌丝体为受体在 MS 培养基上转化效率是10~(-6)~10~(-5),在其他培养基上接合转移予少或得不到接合子。因而确定 MS 培养基为玫瑰黄链霉菌接合转移的培养基。另外,抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显,16~18 h 覆盖效果最好。转化后,我们对接合转移的转化子进行了进一步的验证。将质粒 pKC1139接合转移转化子接种到含安普霉素和萘啶酮酸的 SGGP 液体培养基中培养,提取链霉菌质粒,电泳检测没有明显的条带, 将提取物浓缩转入 E.col iJM109感受态细胞中,分离得到的质粒与转入 ET12567(pUZ8002,pKC1139) 中的 pKC1139大小一致,均为6.5kb。进一步选择 Men-myco-93-63中不存在,pKC1139中存在的安普霉素(aac(3)Ⅳ)抗性基因的两对引物,分别以 pKC1139质粒和 E.coliJM109中分离得到的质粒, 以及野生型 Men-myco-93-63为模板进行扩增,发现前两者中均能扩出700bp 和286 bp 的片段,而野生型 Men-myco-93-63中没有扩增片段,与预期相符。证实了 pKC1139已成功转入 Men-myco-93-63 中。并且用同样的方法,证实了质粒 pSET152也己成功转入到 Men-myco-93-63中。玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63接合转移转化体系的完善和优化,为该生防菌分子水平的操作提供了平台,为研究该生防菌株的抗生素合成代谢途径、调控机理及遗传改良等奠定了重要的基础。

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