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玉米弯孢叶斑病菌Brn1的克隆与功能分析

姜雪  徐书法  王兵  刘力行  陈捷  
【摘要】:近年来,玉米弯孢叶斑病在我国各主要的玉米产区均造成了较大的为害,逐渐上升为玉米重要病害之一。玉米弯孢叶斑霉菌[Curvularia lunata(Wakker)Boed] 是引起该病的主要病原,存在着严重的致病性分化。关于该病害的发生规律、品种资源抗性鉴定、病原流行学已有一些研究,但是该病害致病性相关基因方面的研究较为薄弱。本研究利用双向电泳、MALDI-TOF MS 质谱分析技术,比较研究强致病类型和弱致病类型病菌蛋白质图谱差异,鉴定出色素合成相关 Brn1 蛋白的氨基酸序列,据此利用 RACE 技术,克隆出 Brnl cDNA 全长1001bp序列(GenBank accession No.DQ358052)。采用半定量 PCR 方法,比较了 Brn1 在病菌不同生长阶段的表达规律,结果表明 Brn1 基因在96 h的表达量明显大于24 h,72 h 的表达量;在菌株生长的过程中,Brn1 在玉米弯孢菌强致病菌株中的表达明显大于弱致病菌株,说明该基因的表达与病原菌的致病性有关。通过三环唑抑制性试验和 Nothern Blot 证明该基因表达水平与致病性相关。为了进一步在分子水平上验证 Brn1 与致病性的关系,我们试利用同源重组的方法对该基因进行敲除。首先根据已知的 Brn1 基因全序列,克隆出基因序列两侧各约500bp 的基因片段,作为两端同源臂序列,改造带有潮霉素和氨苄抗性基因的质粒 pv2,构建重组载体,然后通过 ATMT 转化方法获得相应敲除突变子。对突变子表型和致病性变化进行检测,以验证 Brn1 在玉米弯孢叶斑病菌中的功能。

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