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Microbial Degradation of Cyanide using Pseudomonas aeruginosa KT-C001 and Expression of Cyanide Hydratase Gene

【摘要】:本室从清华大学环境工程系经多种工业废水长期培养驯化的活性污泥中分离到一株可以以氰化物为唯一碳、氮源的降解细菌 KT-C001。经形态、生理、生化实验和16srRNA 基因序列比对鉴定该菌为 Pseudomonas aeruginosa,己保藏于中国普通微生物菌种保藏中心, 编号为 CGMCCl445。研究发现,该菌的静息细胞在52小时内对氰化物的降解率为78.45 %。菌体不仅可以降解氰化物,还可以利用苯、苯酚、甲苯、二甲苯和喹啉。通过 PCR 技术从 Pseudomonas aeruginosa KT-C001扩增到一段氰化物水合酶基因的片段 cya-1。经序列分析发现 cya-1的氨基酸序列与 Pseudomonas sp.的其它推测的氰化物水合酶基因的氨基酸序列相似性很高。经 RT-PCR 分析发现 cya-1的表达受到氰化物的诱导。体外表达后,重组蛋白的分子量约为34.7KDa,细胞上清液酶活为35.8mg/l-min-mg protein。纯化后的重组蛋白的酶活为859.2 mg/l-min-mg protein。测定了纯化后重组蛋白的酶反应动力学参数,结果如下: 底物浓度范围:0.3mM~0.6mM;米氏常数为0.27 mM;酶作用的最适温度和 pH 分别为35℃和7.5。Mn~(2+)浓度在100μM~400μM范围内对酶活有促进作用。由于本文克隆的降解基因采用的模板序列是已测序的 Pseudomonas aeruginosa PAO1的基因组中的一个推测蛋白的基因,故可以认为本文克隆的氰化物水合酶基因 cya-1是一个证明有功能的新基因,这为今后构建降解氰化物的基因工程菌提供了良好的材料。

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