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辽东楤木细胞色素P450基因的鉴定、分类与功能分析

于锡宏  程瑶  佟雪姣  刘汉冰  蒋欣梅  
【摘要】:辽东楤木[Aralia lata(Miq.)Seem]是五加科(Araliaca)楤木属(Aralia)的一种药食两用植物,其嫩芽是上等的山野菜,其叶片、根皮和茎皮均可入药,中药名"刺龙芽"。细胞色素P450基因是庞大、复杂的超基因家族,参与多种生物过程,特别是次生代谢物质合成,如三萜皂苷的生物合成。基于辽东楤木根、茎、叶不同组织的转录组测序,通过与Pfam数据库进行HMM检索及同源序列比对,鉴定出111个有完整编码区序列和143个部分编码区序列的P450基因。将111个有完整ORF的P450基因提交P450命名委员会进行命名,并进行了进化分析、motif分析、KEGG富集分析、表达模式分析,对3个可能参与三萜皂苷合成的P450基因进行了CDS克隆,并进行了亚细胞定位和诱导表达分析。111个全长的P450基因首次在辽东楤木中被鉴定出来,并分成了7个簇,36个家族和64个亚家族,系统进化分析将其分成了两大类,A型(53%)和非A型(47%),其中CYP71是最大的簇,含有16个家族,59个基因,包含了全部A型P450基因。其余的6个簇包含了52个非A型基因,分别属于20个基因家族。P450所编码的氨基酸数在410~620之间,分子量46.8~69.5 kD,等电点6.01~9.55;其中104个蛋白属于亲水性蛋白,所有P450编码蛋白均定位于内质网膜上。Motif分析结果表明,所有的P450都含有P450 domain(pfam00067)和P450典型的结构域:PERF序列(PERF motif)、K螺旋(K-helix region)、I螺旋(I-helix region)和血红素结合结构域(heme-binding region)。KEGG分析将34个P450基因富集到18个代谢通路中,主要参与次级代谢物或天然产物的合成。在不同组织中筛选到97个差异表达基因,其中46个在叶片中上调表达,26个在根中上调表达,23个在茎中上调表达。挑选了15个P450基因进行qRT-PCR验证,验证结果与测序结果基本一致。P450中的CYP716家族是催化齐墩果烷型三萜皂苷形成的关键酶基因,从辽东楤木中克隆得到3个参与三萜皂苷合成的CYP716基因:CYP716A295、CYP716A296和CYP716U5,这3个基因编码蛋白均定位到内质网膜上。MeJA和ABA诱导表达分析结果表明:3个三萜皂苷合成相关基因在转录水平上均受到MeJA和ABA诱导调控,并与MVA和MEP途径中的基因存在共表达关系。

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