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香蕉MuMADS2基因正反义表达载体的构建(摘要)

刘琳  杨晓颖  刘菊华  金志强  徐碧玉  
【摘要】:【背景】MADS-box基因(MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS和SRF)是一个序列特异的调节基因家族,所编码的蛋白为转录因子,广泛存在于动物、植物和真菌中,通过调节其它基因的转录来发挥其调控作用。植物的MADS-box转录因子的功能主要包括三个方面:其一是,决定花分生组织的特性;其二是,决定花器官的特性;其三是,通过联合作用的方式,决定不同花轮器官的特性。2002年,Vrebalov等(Vrebalov et al.,2002)发现番茄中的一个MADS-box基因LeMADS-RIN与果实的成熟密切相关,并且是乙烯上游的一个调控因子。Sung等人(2000)从苹果中分离到的一个MADS-box基因MdMADS4,在果实中有一定量的表达,且在心皮维管束中的表达水平很高,从而认为它在果实发育中起作用。在跃变型果实番茄中,在发育早期分离到了7个MADS-box基因,酵母双杂交结果表明这些基因编码的蛋白是以二聚体的形式共同完成其功能的(Busi et al.2003)。利用反义技术,可以使其发生突变,产生单性结实(Ampomah-Dwamena et al.2002)。在非跃变型果实草莓中,分离出一个果实特异表达的MADS-box基因,与LeMADS-RIN同源。这些结果表明MADS-box蛋白可能是跃变型果实和非跃变型果实共有的果实成熟调节者(Moore et al.2002)。【目的】对前期克隆的转录因子MuMADS2基因构建正、反义真核表达载休,为研究其功能及其作用机制奠定基础。【方法】根据我们已获得的MuMADS2基因全长序列,设计合成2对引物,正义载体上下游引物分别加入NcoⅠ和SpeⅠ酶切位点,反义载体上下游引物加入酶切位点相反。通过PCR扩增,获得带有酶切位点的MuMADS2基因片段(770bp),分别插入克隆载体pMD18-T,构建pMD18-MuMADS2和pMD18-MuMADS2-anti载体。经限制性核酸内切酶酶切后,分别插入到pCAMBIA1302载体35S启动子的下游,GFP基因的上游,使MuMADS2与GFP形成融合蛋白,由35S启动子启动表达,构建正反义真核表达载体,并经测序证实,分别命名为pMD18-MuMADS2和pMD18-MuMADS2-anti。【结果】通过PCR和酶切,检测出和目的片段相同的片段,正反义DNA片段长度均为770bp,DNA测序表明编码序列与ORF完全相同。【结论】成功构建MuMADS2正反义重组真核表达载体,为进一步鉴定该基因的功能打下基础。

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