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猕猴桃PMI/甘露糖遗传转化体系的建立(摘要)

秦于玲  秦永华  胡桂兵  徐昌杰  张上隆  
【摘要】:以猕猴桃品种"布鲁诺"实生无菌苗叶片为外植体,在探讨不同浓度甘露糖对猕猴桃再生影响的基础上,用根癌农杆菌介导法将构建的以PMI为筛选基因、韧皮部特异启动子(PSP)驱动的抗菌肽D基因(图1)导入到猕猴桃基因组中。结果表明,甘露糖对猕猴桃叶片不定芽的分化有显著影响。猕猴桃叶片接种在不加甘露糖的分化培养基上,30天后,不定芽分化率达100%,平均每个外植体再生芽6.8个;随着甘露糖浓度的提高,不定芽分化率逐渐降低,当甘露糖为20g/L时,不定芽分化率为8.2%,平均每个外植体再生芽2.0个;当甘露糖为25 g/L时,不定芽的分化则完全受到抑制。因此,在猕猴桃遗传转化中用甘露糖为筛选剂时,筛选浓度以25 g/L为宜。利用建立的甘露糖筛选体系,对猕猴桃进行遗传转化,获得了抗性植株(图2 A,B)。根据甘露糖代谢时可使培养基酸化,指示剂氯酚红在pH6.4时呈紫红色,随着pH下降转变为黄色的原理,随机取30株抗性植株幼叶进行氯酚红(CPR)检测,结果表明,有6株可以使检测培养基(MS+甘露糖2.5 g/L+CPR 50 mg/L)呈现黄色或橙黄色的变化,说明PMI表达活性;而对照培养基(MS+蔗糖2.5 g/L+CPR 50 mg/L)溶液颜色无变化(图2 B),氯酚红检测的转化率为20%。分别以PMI、GUSA、PSP、CAPD,ChvA基因和35S启动子两端序列设计特异引物(表1),随机取46株抗性植株,以未转化猕猴桃植株DNA为阴性对照,以质粒pCAMBIA1301-PMI-PSP-CAPD为阳性对照进行PCR检测。结果46株抗性植株中共有7株扩增出特异条带,且与阳性对照扩增出的特异条带一致,而非转基因的猕猴桃植株则没有特异性条带出现(图3 A-E)。而用ChvA基因两端引物对抗性植株进行PCR检测则没有特异性条带出现,从而排除了农杆菌污染造成的假阳性(图3 F);PCR检测的转化率为15.2%。PCR和CPR检测结果初步表明,PMI基因已经整合猕猴桃基因组中并得到表达,目前正在进行标记基因和目的基因的Southern和RT-PCR等分子检测。

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