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植物基因组单碱基替换技术在水稻上的开发及应用

任斌  严芳  旷永洁  张大伟  林宏辉  周焕斌  
【摘要】:近年来,基因组定点编辑技术作为一种重要技术手段在植物学研究和作物品种改良中得到了广泛应用。然而,相对于常见的基因功能缺失突变体创制,对植物基因组特定位点进行碱基替换以得到基因功能获得性突变体或进行基因矫正仍然具有一定的挑战性。最近,在哺乳动物细胞中,利用由Cas9n切口酶分别与胞嘧啶脱氨酶(人胞苷脱氨酶AID、大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1或七鳃鳗胞苷脱氨酶CDA1)和大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶radA组成的碱基编辑器成功地实现了单碱基替换。在本研究中,我们开发了一系列的水稻碱基编辑器工具盒(rice Base Editor),并成功地在水稻中对特定靶标基因进行了单碱基定向替换,人工创造基因新功能种质材料。首先利用由Cas9n和APOBEC1组成的rBE3和rBE4对水稻基本性抗性途径中的两个关键基因OsSERK1和OsSERK2、水稻隐性抗稻瘟病基因pi-ta、以及水稻理想株型IPA1基因实现了靶位点碱基的特异替换(G·C转换为A·T)。由于APOBEC1的碱基偏好性和水稻基因组的高GC特性,我们又引入AID的高活性突变体版本,开发了rBE5和rBE9升级版碱基编辑器,高效地对水稻中8个内源基因进行碱基替换,表明新的人源AID成功解决了胞嘧啶脱氨酶对基因组DNA序列的偏好性问题。为了实现水稻基因组中A·T转换为G·C,利用TadA的两个突变体radA*7.10和radA*7.8与Cas9n融合,开发了rBE14碱基编辑器,对OsMPK6、OsMPK13、OsSERK2、OsWRKY45多个水稻内源基因靶位点编辑,成功获得预期的水稻突变体材料。水稻单碱基编辑技术的开发和应用对于水稻基因功能解析和现代分子育种研究具有重大推进作用,特别是对水稻品种的缺陷型基因进行修饰矫正,有利于加快水稻育种进程以及延长现有品种的商业周转期。

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