日本血吸虫核酸疫苗体内电穿孔法的进一步研究

【摘要】：目的进一步探索体内电穿孔技术增强血吸虫核酸疫苗免疫保护作用的稳定性、可靠性及可重复性。方法大量制备日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗。96只5-6周龄的BALB/c雌性小鼠随机分成A、B、C、D、E、F、G、H 8组,每组12只,其中A组(空质粒对照组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl pcDNA3.1质粒DNA;B组(电穿孔空质粒+鸡尾酒式蛋白疫苗组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl pcDNA3.1质粒DNA,每次DNA疫苗免疫后即辅以体内电穿孔,于第9周每只小鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐剂(FCA);C组(鸡尾酒式DNA疫苗组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗;D组(鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)鸡尾酒式DNA疫苗免疫方法同C组,于第9周每只小鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA;E组(电穿孔鸡尾酒式DNA疫苗组)鸡尾酒式DNA疫苗免疫及体内电穿孔方法同B组;F组(电穿孔鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)鸡尾酒式DNA疫苗免疫及体内电穿孔方法同B组,但于第9周每只小鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA;G组(TPI组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl pcDNA3.1-SjCTPI质粒DNA;H组(电穿孔TPI组)pcDNA3.1-SjCTPI质粒DNA疫苗免疫及体内电穿孔方法同B组。DNA疫苗末次免疫后4周,蛋白疫苗加强免疫后2周,所有小鼠同时经腹部皮肤感染40±1条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠,计数各小鼠成虫数和肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血,分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a,并取小鼠脾脏制备单个脾细胞悬液,脾细胞经ConA和SEA刺激后,采用流式细胞仪检测上清中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果 B-H实验组的减虫率分别为14.77%、32.54%、43.95%、41.47%、59.38%、27.23%和42.37%,相对于对照组(A组)检获的成虫数均显著降低(P均0.01),D组的减虫率显著高于C组和B组(P值分别为0.01和0.05),经电穿孔处理后,E组和H组的减虫率分别显著高于C组和G组(P值分别为0.05与0.01),而F组的减虫率显著高于D组和E组(P值均0.01);B-H实验组的减卵率分别为20.62%、44.06%、57.57%、52.83%、67.49%、27.25%和42.75%,相对于对照组各实验组肝脏内虫卵数显著下降(P均0.01),D组的减卵率显著高于B组和C组(P值分别为0.001和0.05),经体内电穿孔处理后,E组和H组的减卵率分别显著高于未经电穿孔处理的C组和G组(P值分别为0.05与0.001),F组的减卵率可达67.49%,显著高于D组和E组(P值均0.05);各实验组均可检测到特异性的IgG抗体。经SEA特异性刺激后,各实验组的IL-2和IFN-γ水平较对照组明显升高,而IL-4则未检测到。结论 DNA疫苗通过体内电穿孔再结合蛋白疫苗的联合应用可较大程度的提高疫苗的免疫保护作用,表明该免疫方法具有较好的可重复性和稳定性,是一种较理想而且可行的血吸虫病免疫策略。