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《中国作物学会马铃薯专业委员会2008年马铃薯大会论文集》2008年
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黑曲霉3.758及3.324的葡萄糖氧化酶基因比较研究

张鹤龄  押辉远  张利梅  曹先维  张剑峰  姜伯玮  张岩芳  
【摘要】:用淀粉-KI 培养基研究了黑曲霉(Aspergillus niger)3.758及3.324的葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase,简称 GOD)的活性,结果黑曲霉3.324有活性,而3.758无活性。SDS-PAGE 结果表明,黑曲霉3.324能编码完整的有活性葡萄糖氧化酶,而黑曲霉3.758则不能编码具有活性完整的葡萄糖氧化酶。用 LA Taq DNA 聚合酶,以黑曲酶3.758基因组 DNA 为模板。PCR 扩增,获得1.8 kb 片段。连接于 pUCm-T 载体上进行了克隆和序列分析。结果和国外常用于基因克隆的黑曲霉(ATCC9029)的 GOD 基因序列相比较,只有三个碱基不同。其中1245位的 C 变为 T.1539位的 T 变成 C,761位的 G 变成了 A。前二者均在密码子的第三位突变,氨基酸未变。而761位突变,便使 TGA→TAG,而此处发生了琥珀无义突变。现使其 GOD 基因编码终止在761位,因此该菌自己不能编码完整的 GOD 酶蛋白,因此不表现酶活性,而当用 SDS-PAGE 也不会出现 GOD 酶蛋白的特异带,这和上述结果是一致的。依同法,用 pGEM-T easy 栽体克隆了黑曲霉3.324的 GOD 基因,并进行序列分析。同时比较研究了3.758和3.324 GOD 基因的同源性。发现有35个碱基不同,导致8个氨基酸发生了变化,同时大部分碱基的改变均发生于 GOD 基因的中间部分,其 N 端 C 端同源性较高。此外黑曲霉3.324 GOD 基因 GC 含量下降.为57.9%。同时在761位无琥珀无义突变产生。这使得黑曲霉3.324能编码出完整的酶蛋白,且在淀粉-KI 培养基并显示出酶活性,而在 SDS- PAGE 可以看出其 GOD 酶蛋白的条带。 GOD 可以氧化葡萄糖产生 H_2O_2,而 H_2O_2可作为植物自然防御系统的传递信号,诱导细胞产生过敏性坏死反应,并可使植物产生获得系统性抗病性,同时激活植物抗毒素合成及致病相关蛋白的表达。

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