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《浙江省免疫学会第六次会员代表大会暨第十一次学术大会论文汇编》2018年
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拟穴青蟹羧肽酶B基因在先天性抗病免疫中的作用机理

钱希逸  朱斐  
【摘要】:羧肽酶B(Carboxypeptidase B,CPB)是竣肽酶的一种,它是含锌的外分泌蛋白,能切多肽羧基末端的赖氨酸或精氨酸。但还没有在虾蟹类甲壳动物中研究羧肽酶B的作用及作用机理。本研究克隆了一条在拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)肝胰腺中特异表达的竣肽酶B(Carboxypeptidase B,CPB)基因,研究了拟穴青蟹在感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)时,CPB基因所发挥的免疫功能。羧肽酶B的cDNA序列全长为2316bp,软件分析显示该基因的开放阅读框大小为1302bp,编码一个含有434个氨基酸残基的蛋白,蛋白质的相对分子质量为48.514 kDa,pI为8.494。氨基酸序列比对和进化树分析显示CPB基因主要存在于甲壳动物中,其中在拟穴青蟹中发现的CPB基因与端足虫(Hyalella azteca)亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测结果显示,CPB基因在肝胰腺中的表达最高,而在血淋巴、鳃、肌肉、肠、心等组织内表达量较低。利用double-strand RNA(dsRNA)干扰技术成功地抑制CPB基因的表达,而在CPB基因被沉默后,拟穴青蟹的多个免疫基因受到影响,如Janus Kinase(JAK)、Signal transducers and activators of transcription(STAT)、C-type lectin、crustin antimicrobial peptid(CAP)、Tolllike receptor(TLR)、(prophenoloxidase)proPO、myosinⅡessential light chain-like protein(MELCLP)基因的表达显著下调。免疫活性指标检测试验显示,在抑制了CPB基因的表达后,青蟹血细胞总数上升,酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性增强。进一步研究发现,在感染溶藻弧菌后,CPB基因的表达明显下调。在感染WSSV后,CPB基因的表达也明显下调。WSSV拷贝数试验结果显示在CPB基因被敲除后,拟穴青蟹体内WSSV拷贝数显著降低。抑制CPB基因的表达后,凋亡试验显示拟穴青蟹血细胞的凋亡率显著降低。结果说明拟穴青蟹CPB基因可以诱导细胞凋亡,而WSSV有可能通过抑制CPB基因的表达来刺激细胞凋亡。本文首次揭示了CPB在拟穴青蟹病毒感染中有着重要作用,为研究拟穴青蟹的先天性免疫和WSSV感染宿主的机制提供了重要的理论依据。
【作者单位】:浙江农林大学动物科技学院
【分类号】:S945

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