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WNK4激酶对肾脏钙激活钾通道的调节作用和机制研究

庄捷秋  王德选  杨青  周波  蔡晖  
【摘要】:目的假性醛固酮减少征Ⅱ型(PHAⅡ)是一种少见的常染色体显性遗传性疾病,临床上表现为高血压、高钾血症、高氯血症、代谢性酸中毒和正常的肾功能。WNK(with no lysine(K))激酶是一类新发现的丝氨酸/苏氨酸激酶,其家族中两个成员WNK1和WNK4的突变能导致PHAⅡ。Maxi K是大电导钙和电压激活的钾通道,我们的前期研究发现WNK4能显著抑制Maxi K的功能。为进一步探讨其调节的分子机制,我们将在Cos-7细胞上研究WNK4激酶对Maxi K的影响。方法将myc-Maxi K和myc-WNK4野生型(WNK4-WT)或CD4(作为对照)共同转染进Cos-7细胞中,分别采用化学发光法、细胞表面免疫沉淀法和细胞表面生物素化法检测Maxi K在Cos-7细胞表面的表达、细胞表面膜蛋白和总蛋白的表达水平。使用Bafilomycin A1(BafA1)阻断溶酶体降解途径研究Maxi K细胞表面膜蛋白表达水平的减少是否由于其蛋白降解增多所致。结果1.化学发光法检测结果显示,在CD4对照组中Maxi K的表面膜蛋白表达水平为299.9±18.6相对单位,而在WNK4-WT组中其表面膜蛋白表达水平为148.4±13.7相对单位,比对照组显著下降(p0.001,n=3)。2.细胞表面免疫沉淀实验显示,与CD4对照组相比,WNK4-WT组Maxi K的细胞表面膜蛋白和总蛋白表达水平均显著减少。3.细胞表面生物素化实验结果显示,与CD4对照组(100%)相比,WNK4-WT组Maxi K的表面膜蛋白(32.7±11.7%,p0.05,n=3)和总蛋白表达水平(26.1±8.5,p0.05,n=3)均显著减少。4.通过使用BafA1阻断溶酶体的降解通路发现,和对照组(100%)相比,WNK4-WT显著减少maxi K的总蛋白水平(42.3±15.2%,p0.01,n=4),而BafA1(0.5μM)则逆转WNK4-WT对Maxi K蛋白的抑制作用(82.2±12.1%vs 42.3±15.2%,p0.05,n=4)。结论WNK4激酶能同时抑制Maxi K在Cos-7细胞表面膜蛋白和总蛋白表达水平。WNK4激酶抑制Maxi K在细胞表面膜蛋白的表达是通过增加Maxi K蛋白在溶酶体内的降解所致的。

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