Mdr1在Lewis肺癌化疗中疗效及骨髓保护的实验研究

【摘要】：【目的】探讨 mdr1基因转染移植骨髓造血细胞在 Lewis 肺癌模型中疗效及骨髓的保护作用。【方法】 1、PCR 法体外克隆出目的基因并将该基因采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质粒 pAdTrack-CMV 中,采用同源重组方法将该质粒和腺病毒质粒 Adeasy-1连接,最后通过脂质体介导的方法导入包装细胞 HEK293中,产生表达目的基因的重组腺病毒 Ad5-MDR1;2、采用乒乓交互感染收集并浓缩病毒上清,采用浓缩病毒上清转染法将 mdr1基因导入肿瘤坏死因子α(TNF-α)预处理后的 C57小鼠骨髓单个核细胞,采用 RT-PCR 法、Western-blot 分别从基因、蛋白质水平检测 mdr1基因在小鼠骨髓单个核细胞中的功能性表达, 柔红霉素排出试验从功能水平检测 mdr1基因在小鼠骨髓单个核细胞中的功能性表达情况,探讨转染时间和转染效率、功能之间的关系;3、将 C57小鼠骨髓单个核细胞与含有人全长 mdr1 cDNA 的腺病毒共培养4日后,将转染细胞经骨髓腔注射移植入经~(60)CO 放疗预处理的 Lewis 肺癌荷瘤小鼠体内,然后进行超剂量表阿霉素化疗实验,检测 mdr1基因对受体骨髓的保护作用、超剂量化疗对肿瘤的治疗作用。同时采用 RT-PCR 法、Western blot 法分别从基因、蛋白水平检测外源性 mdr1基因在受体骨髓的表达情况。【结果】 1、PCR 法克隆出目的基因 MDR1,定向克隆成功构建重组质粒 pAdTrack-MDR1,同源重组腺病毒质粒 Adeasy-MDR1导入包装细胞 HEK293中形成表达 mdr1的高滴度重组腺病毒 Ad5-MDR1。2、收获的病毒感染液滴度达8.3×1011pfu/ml;流式细胞仪测得体外转染率可达到26.26%;柔红霉素排出试验证实导入的 mdr1基因表达产物 P-gp 有药物外排泵功能;RT-PCR 法证实外源性 mdr1基因有效地在小鼠骨髓单个核细胞基因组表达;Western-blot 测得转染后 P-糖蛋白(P-glycoprotein P-gp)表达较转染前明显增高;3、采用培养细胞注射法成功建立 Lewis 肺癌动物模型; 采用骨髓腔内注射移植后一月受体骨髓中有外源性 mdr1基因的功能性表达;超剂量化疗实验中,转染 mdr1基因的荷瘤小鼠能耐受3倍剂量表阿霉素的化疗, 化疗3周后实验组外周血白细胞可维持在正常范围(5.3±0.66),同时肿瘤能被有效治疗,荷瘤动物的生存时间及生存质量明显高于对照组(P0.05),对照组荷瘤动物死于超剂量化疗所造成的严重骨髓抑制或肿瘤扩散。【结论】 1、采用 AdEasy-1腺病毒载体系统重组了 MDR1基因腺病毒 Ad-MDR1;2、通过 TNF-α预处理的方法将 mdr1基因转染单个核细胞的转染率提高到26.26%;RT-PCR 和 Western blotting 方法证实外源性 mdr1基因在转染骨髓单个核细胞基因组中功能性表达,柔红霉素排出试验证实导入的 mdr1基因表达产物 P-gp 有药物外排泵功能;3、检测到外源性 mdr1基因可在受体骨髓中功能性表达1个月;4、采用 mdr1基因转染移植能够有效保护超剂量下化疗药物对骨髓的损伤,同时提高对 Lewis 肺癌的治疗效果。