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家蚕profilin基因克隆表达及其抗体制备

徐江涛  张耀洲  
【摘要】:Profilin是一种低分子量肌动蛋白结合蛋白,存在于目前发现的所有真核生物中。它在高级结构上具有高度的保守性,而序列保守性比较低,似乎蛋白质的折叠上的保守性比一级结构上的保守性更重要。它的高级结构主要包含三个保守的结合域,分别为肌动蛋白结合结构域,多聚L-脯氨酸结合结构域和磷脂酰肌醇(主要是PtdIns(4,5)P2是PtdIns(3,4,5)P3)结合结构域,这三个结构域成为profilin行使功能的基础。除了与肌动蛋白结合,profilin在许多复合物相互作用网络中起到一个控制中心的作用。目前发现profilin在一些细胞过程中如膜转运,小的GTPase信号途径,核内活性及神经疾病和肿瘤形成中起重要作用。Profilin在胞质和细胞核中都存在,目前的研究表明肌动蛋白参与染色质重构和RNA 转运及加工。广泛存在的profilin与很多不同的配体相互作用,包括多聚磷脂酰肌醇,肌动蛋白,肌动蛋白相关蛋白及聚脯氨酸蛋白,profilin可能通过特异的方式连接到不同的信号通路。我们从家蚕cDNA 文库中获得家蚕profilin cDNA,命名为BmPFN,其开放读码框长度381bp,编码的肽链长126aa。经 DNA STAR计算分子量为13.7kD,等电点为6.11。在NCBI中比对与Apis mellifera同源性最高,126 个氨基酸中有102个相同,同源性为80%。通过RT-PCR获得家蚕profilin完整的读码框,设计PCR 引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,双酶切连入pGEX-5x-1大肠杆菌表达质粒,构建成功重组质粒pGEX- 5x-1-BmPFN。将重组质粒转入BL21并诱导表达,经SDS-PAGE鉴定在约40kD处有明显的表达条带,与预测的GST-profilin融合蛋白大小相符。重组蛋白先后经Sephadex G75分子筛层析,DEAE- Sepharose FF阴离子交换及GST亲和柱纯化至SDS-PAGE检测为一条带。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体效价为6.4×105,用重组菌表达总蛋白做Western blotting检测呈一条带。

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