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连续荧光监测法测定蛋白酶体活性及其在筛选蛋白酶体抑制剂中的

周永列  吕亚萍  许武林  胡惟孝  
【摘要】:目的建立用连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的方法,研究其在蛋白酶体抑制剂筛选中的应用价值。方法用特异性的荧光多肽底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(Suc-LLVT-AMC),Z-Val-Val-Arg_AMC(ZVVA-AMC),Z-Leu-Leu-Glu-βNA(ZLLG- BNA),用连续荧光监测法分别测定蛋白酶体糜凝乳蛋白酶样(chymotrypsin-like,CT-L)、胰蛋白酶样(trypsin-like,T-L)和肽基谷氨酰肽水解酶样(PGPH-like,PGPH-L)活性,对测定条件最优化,并进行了其方法学评价。用该法测定了目前临床公认的蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib又称PS-341)和课题组自主合成的一种潜在的蛋白酶体抑制四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1),对20S蛋白酶体和B16、Namalwa细胞蛋白酶体提取物的抑制作用。结果连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的最适pH 8.2:0.3g/L SDS对CT-L活性有激活作用;CT-L、T-L、PGPH-L的Km分别为3.55、4.12、4.88μmol/L;酶反应进程曲线的线性期达20min;酶活性测定的线性范围为20S蛋白酶体的蛋白浓度达100μg/L、120μg/L、100μg/L,B16细胞蛋白酶体提取物的蛋白浓度均达200mg/L;精密度为批内CV为(2.25~5.78)%,批间CV在(3.75~8.42)%。用该法测定PS-341对20S蛋白酶体CT-L、T-L、PGPH-L的抑制活性,其IC50分别为12.36、12.42、24.40nmol/L;测定ZGDHu-1对20S蛋白酶体的抑制活性,IC50分别为2.24、0.92、0.51μmol/L。结论连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的方法为快速、有效、大规模筛选蛋白体抑制剂药物提供了一个技术平台,也为临床上应用蛋白酶体抑制剂提供了一个有用的检测指标。

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