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《中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编》2008年
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肠出血性大肠杆菌O157:H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定

杨琴  阎有功  曹军皓  
【摘要】:背景肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7是一种重要的传染性病原菌,可引起多种致死性疾病的爆发流行。Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)是近年来发现的O157:H7的一种新的重要的毒力因子,在O157:H7粘附宿主细胞造成"粘附与擦拭"(A/E)损伤过程中起重要作用,为O157粘附宿主细胞、形成肌动蛋白踏板、造成A/E损伤所必需。目的采用基因工程的方法对肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)进行了克隆表达、纯化,进而在此基础上制备了高滴度和高特异性的兔抗TccP多克隆抗体并对其抗原性进行了实验研究。方法首先选择EHEC O157:H7 Sakai菌株基因组为模板,采用PCR及序列测定等方法获得EHEC O157:H7 tccP DNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对在C末端融合了6his纯化标签的表达产物进行Western blotting法分析;使用Ni2+-NTA离子换树脂进行蛋白纯化;纯化蛋白进行SDS- PAGE纯度分析。以纯化TccP-6his融合蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备了有较高滴度和特异性的兔抗TccP多克隆抗体。以所获特异性多克隆抗体作为一抗,使用双向免疫扩散、ELISA、Western blotting等方法检测标本中TccP蛋白。结果成功构建了原核表达质粒pET-28a(+)-tccP;Western blotting结果表明,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了分子量为37kD左右的目的蛋白;表达产物经Ni2+-NTA离子交换树脂纯化,TccP-6his融合蛋白纯度为95%以上。免疫扩散检测可见兔抗TccP多克隆抗体稀释度为1:32时,仍呈现明显沉淀线;ELISA检测结果抗体滴度为1:640 000;Western blotting检测表明:用兔抗TccP多克隆抗体与TccP抗原进行免疫印迹,在分子量约37kD处有一特异性条带,与阳性对照纯化TccP-6his融合蛋白相一致。结论tccP基因的克隆表达、纯化,TccP蛋白的获得以及特异性兔抗TccP多克隆抗体的制备及应用成功,为后续进一步研究TccP在O157致病机制中的作用奠定了坚实的基础。
【作者单位】:广州军区武汉总医院检验科
【分类号】:R378;R346

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