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《中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编》2008年
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H-2Kd基因siRNA表达质粒的构建及在小鼠LAK细胞的表达

庄学伟  夏西燕  单宁宁  王洪春  张义  杨晓静  李晓丽  赵胜梅  邹雄  
【摘要】:目的构建针对BALB/C小鼠H-2Kd基因siRNA表达质粒,观察其在小鼠LAK细胞的表达,为进一步研究H-2Kd基因功能奠定基础。方法:设计siRNA干涉靶序列,合成两段寡核苷酸构建质粒pSilencer 3.0-H1,首先将合成的两段寡核苷酸等量混合,95℃作用3min,37℃孵育1h,然后将结合的双链寡核苷酸与带有BamHI和HindⅢ粘性末端的质粒连接,最后将连接成功的质粒转化DH5a大肠杆菌,经氨苄青霉素筛选,挑选耐药菌落,大量培养,质粒的提取及纯化采用经典的碱裂解法和聚乙二醇质粒纯化法,BamHI和HindⅢ进行双酶切鉴定,DNA琼脂糖凝胶电泳及应用M13的通用引物测序,以确定合成的寡核苷酸是否已经转入pSilencer3.0-H1质粒中。常规无菌制备小鼠脾细胞悬液,收集淋巴细胞后,用含10%胎牛血清的RPMI1640稀释至浓度为1×109/L,置于含白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2) 1000U/mL,10%胎牛血清的RPM11640完全培养基中,37℃,5%CO2中培养。小鼠脾LAK细胞培养36h后调节细胞浓度,4×105个细胞/200?L孔接种于24孔培养板中,随机分为6组,每组设5个复孔,加入质粒DNA与脂质体为4/1.25、8/1.25、4/2.5、8/2.5、4/5、8/5?g/?L分别设为2、3、4、5、6、7组,单纯脂质体设为8组,空白对照和无关序列质粒设为1、9组,84h后采用流式细胞仪检测蛋白抑制情况,各组细胞每孔取100μL与FITC标记的抗H-2Kd单克隆抗体及同型对照混合培养30min,流式细胞术检测iRNA对靶蛋白的抑制情况。结果:用BamHI和HindⅢ进行双酶切经琼脂糖凝胶电泳检测发现,经碱裂解法提取的质粒大小与试剂盒中所带阳性质控质粒大小相同,且分子量为2.8kb,其大小与预期结果大致相同,测序结果与插入的寡核苷酸的序列完全相符,表明已经成功构建了针对H-2Kd基因的表达质粒,流式细胞检测证实siRNA能够抑制靶蛋白的表达,不同剂量的质粒对靶蛋白均有明显的抑制作用,其中7组H-2Kd蛋白的表达降低最明显(67.95±5.70),8组为空转染组,仅加入较大剂量转染剂,对靶蛋白无明显抑制作用(92.51±4.90),9组为无义序列组,非特异性序列并未引起H-2Kd蛋白表达的下降(94.16±6.40)。结论:成功构建了针对H-2Kd基因的siRNA表达质粒并抑制了其表达。

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