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《中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编》2004年
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细胞内钙信号对心肌肥厚转录因子及胚心标志基因的调控

祝善俊  杨永健  祝之明  
【摘要】:目的为阐明钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)信号通路在心肌肥大的发生、发展过程中的作用,AngⅡ刺激心肌细胞外Ca2+内流和雷尼丁(ryanodine,RY)刺激胞内贮存Ca2+的释放,观察其对心肌细胞CaN信号通路的影响,同时阐明钙信号的变化是否影响ERK1/2,及心脏结构基因β-MHC和功能蛋白α-actin的表达,明确不同来源的细胞[Ca2+]i对心肌重构相关信号转导的影响。方法按simpson’s方法培养Wist-ar大鼠乳鼠心肌细胞,将负载Fura-2的心肌细胞置于倒置荧光显微镜下(01ympus),用PTI荧光成像系统进行测定,钙荧光的激发波波长为340/380nm,发射波波长为510nm,荧光信号用Felix专用软件处理;应用特异的钙敏感指示剂Fura-2/AM测定心肌细胞的[Ca2+]i。Western blot:培养的心肌细胞按Bradford’s提取心肌细胞蛋白,按CBG法定量。上样量40ug,8%SDS胶电泳,转膜,固定,洗膜,加Ⅰ抗体,抗兔IgG二抗,将PVDF膜置于NEN化学发光试剂中反应1-3min,常规方法显影定影。凝胶成像系统进行灰度分析。并进行RT-PCR。结果AngⅡ、RY呈浓度依赖性促心肌细胞[Ca2+]i增加,各刺激组[Ca2+]i与对照组相比差异显著(P0.01);CaN主要表达于正常心肌细胞胞浆,核膜周围可见明显表达,AngIIRy刺激24h,CaN除表达于心肌细胞胞浆外细胞核明显着色深染,核膜周围表达更明显。CsA可明显抑制RY(终浓度为10-7mol/L)刺激的心肌细胞CaN蛋白表达量的增加,RY刺激组与正常对照组及RY+CsA(浓度为100μg/L)刺激相比差异非常显著。AngⅡ、RY刺激心肌细胞24h、2d,NFA T3蛋白表达明显增加,各刺激组与对照组相比差异非常显著。AngⅡ、RY刺激心肌细胞1、2d,GATA4蛋白表达明显增加,各刺激组与对照组相比差异非常显著。大鼠心肌细胞表达两种ERK蛋白同型体:ERK1和ERK2,其分子量为42KDa和44KDa。结果经凝胶成像系统分析光密度值显示,AngⅡ、RY(终浓度为10-7mol/L)刺激心细胞24h,ERK1/2蛋白表达量明显高于对照组。AngⅡ、RY(终浓度为10-7mol/L)刺激心肌细胞1、2、3d,Westernblot结果经凝胶成像系统分析光密度值结果显示,α-actin蛋白表达呈逐渐上升趋势,各刺激组与对照组相比差异非常显著。RT-PCR结果显示,AngⅡ、RY刺激30min、2h、24h心肌细胞β-MHCmRNA表达呈逐渐增加趋势,各刺激组与对照组相比差异非常显著。结论本研究表明,Ca2+是多种信号转导的交汇点,在多途径信号转导中起中心调节作用,通过一系列的信号转导活化多种心肌肥厚的相关基因。(收稿日期:2004-09-08)

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