缺氧复氧心肌细胞NF-κB活化调控iNOS基因表达及NO释放

【摘要】：目的探讨培养心肌细胞缺氧复氧对NF-κB活化及其iNOS mRNA表达和NO的释放。方法24h内Wister大鼠培养的第二代心肌细胞,先采用高纯度的氮气模拟缺氧环境后再复氧造模。分别对造模前正常心肌细胞和造模后缺氧复氧心肌细胞进行实验,选用NF-κB p65标记和免疫细胞化学方法观察NF-κB在细胞浆、核中的表达;以Triprue试剂提取两组心肌细胞总RNA。使用核酸蛋白测定仪鉴定RNA纯度和量,所有RNA的A260/280均在1.8-2.0之间。采用TaKaRa RNA PCR试剂盒进行PCR扩增反应。PCR特异性引物。iNOSa引物序列:5′-GTGTTCCACCAGGAGATGTTG-3′和5′-CTCCTGCCCACT-GAGTTCGTC-3′,扩增产物长度为576bp。扩增条件为50℃30minRT反应,94℃2min Rtase失活,94℃30sec、52℃30sec、72℃1.5min;循环34次,72℃延伸5min.β-actin引物序列:5′-CCAAGGCCAAC-CGCGAGAAGATGAC-3′和5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAG-3′;扩增产物长度为:591bp;扩增条件为50℃30minRT反应;94℃2min Rtase失活;94℃30sec、52℃30sec、72℃1min;循环34次,72℃延伸5min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统对条带进行成像,Gel-Pro图象析析系统,对PCR产物特异性表达条带进行半定量分析,β-actin作为内参照。采用硝酸还原酶比色法对两组心肌细胞培养上清液NO进行测定。结果正常培养的心肌细胞可见细胞浆中有深浅不等棕黄色的NF-κB阳性表达产物。模型组可见部分心肌细胞细胞核中有阳性表达,PBS作为一抗心肌细胞中无阳性表达产物。正常培养心肌细胞没有iNOSmRNA的表达,而缺氧复氧损伤的心肌细胞有明显的iNOSmRNA表达(IOD:153000±6243),说明iNOSmRNA的表达是心肌损伤的特征性标志;正常心肌细胞的上清液中NO浓度极低(11.32±4.63),而缺氧复氧心肌细胞上清液NO活性高(51.39±7.64),与正常组比较均有显著性差异(P0.01)。结论培养心肌细胞缺氧复氧造模后可激活NF-κB向细胞核转移,诱导对iNOS mRNA表达和增加NO释放,是缺氧复氧心肌细胞损伤机制之一。

【作者单位】：山东大学山东省立医院 山东大学山东省立医院
【分类号】：R541