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《中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编》2004年
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逆向酶谱法检测TIMP-4抑制MMPs酶解活性

钟理  何国祥  李德  冉擘力  景涛  唐波  
【摘要】:目的用逆向酶谱法来检测TIMPs的活性,国内尚无报道。本实验利用逆向酶谱法检测了重组腺病毒载体Ad.TIMP-4转染大鼠VSMC后,过表达的TIMP-4抑制MMPs的酶解活性。方法构建重组腺病毒载体Ad.TIMP-4,转染至原代培养的大鼠VSMC。在分离胶中提前加入一定量的明胶,灌制积层胶和分离胶,将转染0.5d、1d、2d、4d、6d后浓缩的细胞培养液上样,电泳后置于TritonX-100溶液中,再置于100ml的含标准品MMP-2的酶孵育缓冲液中孵育,用考马斯亮兰R-250染色4h后,脱色,直到背景透明清晰为止。结果逆向酶谱法检测Ad.TIMP-4转染组可见一阳性条带,未转染组和Ad.LacZ转染组均未见阳性条带。结论用酶谱法可间接检测TIMPs的抑制活性,在酶谱法的基础上,人们又发展了可直接反应TIMPs抑制活性的逆向酶谱法。本实验采用逆向酶谱法证实了VSMC转染Ad.TIMP-4后分泌的TIMP-4具有抑制MMPs的生物学活性。我们在摸索、优化实验方法的过程总结了一些自己的经验。

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