腺病毒介导TIMP-4基因转染对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

【摘要】：目的本实验拟构建携带TIMP-4基因的重组腺病毒载体,通过转染体外培养的大鼠VSMC,研究增强其表达对VSMC迁移的影响。方法选用位置特异性构建系统构建携带TIMP-4基因的重组腺病毒载体Ad.TIMP-4转染至培养大鼠VSMC,以免疫细胞化学法、RT-PCR、蛋白免疫杂交检测转染基因的表达。酶谱法及逆向酶谱法检测表达蛋白活性。实验分为未转染组、未转染+PDGF组、Ad.TIMP-4转染+PDGF组、Ad.LacZ转染+PDGF组。Ad.TIMP-4转染组和Ad.LacZ转染组时相点设12h、1d、2d、4d、6d,未转染组与未转染+PDGF组只作无血清培养1d。实验中将配制好的Matrigel基底膜基质涂抹于Millicell培养小室微孔膜上,厚度约0.5mm,室温下静置使Matrigel胶化。计数方法在显微镜下计数5个高倍视野的全部细胞,取三次重复实验细胞迁移数的平均值为相应时相点的迁移细胞数。结果对照组VSMC在元PDGF趋化刺激时,几乎不能通过铺于Millicell膜上的Matrigel基底膜基质。而在培养液中PDGF趋化刺激下,VSMC能穿过铺于Matrigel基底膜基质,从膜的上方移动到下方。在培养液中PDGF趋化刺激下,各检测时相点Ad.TIMP-4转染组VSMC迁移数较未转染组和Ad.LacZ转染组显著减少,并且随转染时间的延长,TIMP-4表达增多,迁移的VSMC数呈更加减少的趋势,VSMC迁移数最大减少78.7%。结论Ad.TIMP-4转染使VSMC表达TIMP-4增强,通过抑制MMPs过高的活性,维持ECM稳态,减少了有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移,且这种抑制作用存在量效关系,从而进一步明确了TIMP-4的生物学活动。