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《第十四届中国中西医结合基础理论学术年会会议资料》2018年
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HSV-2感染VK2细胞不同时间点Toll样受体信号通路的变化

黄聪  段倩旎  乔婷婷  刘桐  邵青青  陈琢  
【摘要】:【实验目的】建立良好的体外HSV-2(生殖器疱疹病毒2型)感染VK2/E6E7(人永生化阴道上皮细胞)细胞模型,研究HSV-2感染VK2/E6E7模型不同时间点TRLs信号通路各关键蛋白分子及终末免疫因子的变化,探索出一种简便稳定快速可扩增出大量满足毒力需求的HSV-2方法,为进一步研究HSV-2发病机制及评价抗病毒药效和探讨药物基于天然免疫TRLs信号通路抗HSV-2的作用机制奠定基础。【实验方法】首先采用以Vero细胞为宿主常规培养法、以VK3/E6E7细胞为宿主连续复壮法和以Vero细胞为宿主浓缩扩增体系法三种方法来扩增病毒,以Reed-Muench法测定每种方法所扩增HSV-2的TCID50和以MTT法测定每种方法所扩增HSV-2感染VK2/E6E7细胞的存活率,来评价其是否达到建模成功的标准、毒力高低、稳定程度和扩增效率。分别在病毒感染细胞的0、2、4、6、12、18和24小时,采用MTT法测定细胞存活率,流式凋亡法检测细胞凋亡率,Western Blot法检测TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、gD、HVEM、MyD88、TRIF、IKBα、P-IKBα、IRF3、P-IRF3、IRF7和P-IRF7蛋白表达水平,免疫荧光法检测gD病毒蛋白表达和NF-KB入核表达情况,用核蛋白提取试剂盒分离核蛋白和浆蛋白,Western Blot法检测上述不同时间点总蛋白、核蛋白和浆蛋白中NF-KB表达情况,Elisa方法检测IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、IFN-α和IFN-β的浓度。【实验结果】以Vero细胞为宿主常规法、以VK2/E6E7细胞为宿主连续复壮法和以Vero细胞为宿主浓缩法三种方法所扩增病毒的TCID50分别为10~(-7.16)、10~(-9.45)和10~(-12.5),而其稀释5倍存活率分别为75.74%±9.66%、49.7%±2.51%和28.31%±2.58%。病毒感染细胞后的0、2、4、6、12、18和24h,细胞存活率逐渐下降,在24h最低,细胞凋亡率逐渐上升,在24h最高。免疫荧光显示gD病毒蛋白表达在胞膜,从12h开始见其荧光表达,而NF-KB在感染后2、4、6h荧光表达在胞浆,从12h入核的荧光表达逐渐增多,两者均在24h荧光表达最多。TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、gD、TRIF、P-IKBα、P-IRF3蛋白和NF-KB核蛋白在病毒感染后12h、18h、24h的表达水平极显著增高,24h最高。TLR2、P-IRF7蛋白和NF-KB浆蛋白在病毒感染后6h、12h、18h、24h的表达水平极显著下降,24h最低。MyD88在病毒感染后6h、12h、18h表达水平显著升高,12h最高。总蛋白NF-KB、IKBα、IRF3、IRF7和HVEM在病毒感染后不同时间点无明显变化。IL-6浓度在病毒感染后4h达高峰,IL-8浓度在18h达高峰,IL-1β浓度在6h达高峰,TNF-α和IFN-β浓度在24h达高峰,而IFN-α浓度在病毒感染后逐渐下降,在24h达最低峰。【结论】三种方法中以Vero为宿主浓缩法所扩增病毒毒力最强。HSV-2感染VK2细胞后,随着时间的延长细胞存活率逐渐下降而凋亡率逐渐上升。Toll样受体信号通路中的关键蛋白和终末免疫因子在HSV-2感染细胞后的不同时间点表达水平不一样,各蛋白和因子均有其对应的关键时间点。HSV-2感染VK22/E6E7是较理想的研究HSV-2的病理生理模型

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