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《遗传多样性:前沿与挑战——中国的遗传学研究(2013-2015)——2015中国遗传学会大会论文摘要汇编》2015年
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人工TALEN核酸酶的构建与鉴定

刘婉霞  严爱芬  刘芳  刘连  蒋泓  冯翠兰  张雅洁  唐冬生  
【摘要】:构建针对人类基因组rDNA序列的TALEN质粒,并构建针对该位点的人类通用基因打靶载体。运用在线软件在人基因组rDNA序列上寻找TALEN识别序列,构建2个TALEN左臂质粒和3个TALEN右臂质粒,通过配伍组合,得到6对TALEN。利用非脂质体转染法将TALEN质粒转染至293T细胞,嘌呤霉素阳性筛选后提取基因组DNA,PCR扩增靶序列,通过测序结果判断TALEN活性,最终得到一对切割活性高达78.5%的TALEN(TALEN-L1R2)。同时,以人基因组DNA为模板,PCR扩增TALEN切割位点两侧基因序列作为左右同源重组引导序列,克隆到载体pUC-19中,得到重组质粒pUC-DS1-DS2。采用In-fusion酶系统将从载体pEGFP-N1中扩增的EGFP表达元件(pCMV-MCS-EGFP)克隆至pUC-DS1-DS2。酶切鉴定和测序证实成功构建人类细胞通用的基因打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2,并证实两种载体共转染能成功将目的基因GFP整合于基因组中。TALEN和基因打靶技术的结合,是一种有效基因组编辑新技术,将为动物基因组编辑和人类基因治疗建立关键技术。
【作者单位】:佛山大学院医学院 广州医科大学基础学院
【分类号】:Q78;Q55

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