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《中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编》2011年
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心脏和肌肉组织特异表达基因HDGC通过HDGC-TP2-GATA4信号途径调控心脏的发育

罗娜  王琨  吴坚  李发祥  黄婷  陈婷芳  邓云  吴秀山  袁婺洲  
【摘要】:我们利用斑马鱼模型深入研究了心脏发育候选基因HDGC的功能。自制了人和斑马鱼HDGC抗体,通过Western blotting、免疫组化及整胚原位杂交结果表明,HDGC在斑马鱼胚胎发育的各时期均有表达,其中在心脏的心室和心房有强烈表达,在小鼠和斑马鱼的成体心脏和肌肉组织中特异性高表达。HDGC基因在大鼠原代心肌细胞、H9C2和C2C12细胞系中大量表达于细胞质中,部分表达于细胞核内,在细胞膜上也有表达。敲低斑马鱼HDGC导致78%的胚胎畸形率,其心脏不能环化。进一步分析表明,环化异常是由于心房和心室细胞数目减少导致心室和心房变小导致的。基因过表达时其腔室增大,并且其敲低表型能被拯救。当用人HDGC抗体免疫沉淀和质谱分析从人胚胎心脏组织全蛋白得到与HDGC的相互作用蛋白TP2。免疫共沉淀和pull-down证明HDGC与TP2相互作用,相互作用区域位于HDGC的193-240AA和TP2的96-351AA。哺乳动物细胞双杂交表明HDGC与TP2及其互作区域在细胞内相互作用。敲低TP2具有与HDGC相类似的畸形率,其表型与HDGC的相同。敲低、过表达和拯救的免疫印记实验表明HDGC或TP2都能得到相同的差异变化,敲低HDGC和TP2的表达都能导致Nkx2.5、Gata4和ANF等的表达明显下调。在稳定细胞系中进行siRNA干扰能敲减HDGC和TP2的表达,过表达增加HDGC和TP2的表达。敲低HDGC的表达能导致TP2表达的降低,反之亦然,说明两者相互维持对方表达蛋白的稳定性。敲低或增加HDGC或TP2都能使GATA4、ANF和α-Cardiac actin表达下调或增多,说明GATA4、ANF和α-Cardiacactin是由HDGC和TP2表达调控的下游蛋白。干扰HDGC和TP2后P53的表达下调,过表达HDGC和TP2后P53的表达量增高。凝胶阻滞EMSA实验表明HDGC结合到CRE位点。CRE-luc荧光报告检测表明HDGC和TP2共同对CRE位点起明显的激活作用。GATA4启动子转录起始位点-2000bp左右有保守的CRE位点。HDGC和TP2相互作用激活GATA4启动子上保守的CRE位点,而不能激活其它的AP-1或NF-kB位点。由上述的实验结果表明,HDGC是一个在心脏和肌肉组织特异表达的心脏发育基因,通过HDGC-TP2-GATA4信号途径调控心脏的发育。

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