海洋细菌Flammeovirga yaeyamensis MY04分泌型多糖降解酶的基因克隆与序列分析

【摘要】：F.yaeyamensis MY04能分泌十余种多糖降解酶,包括耐热、耐碱的琼胶酶系。为发掘该菌株丰富的多糖降解酶基因资源,用pCC1FOS构建了基因组DNA文库,包装滴度是5×10~5CFU/ml,平均插入片段长度大于30kb,总容量超过15Gbp。结合化学染色法,用含多糖底物的多种平板进行了文库的筛选,但未获阳性克隆。对120个随机克隆进行了末端测序,结果得到13个碳水化合物降解酶的基因序列标签;据此进行文库的PCR筛选,得到含分泌型多糖降解酶基因的6个重叠克隆;进行步移测序或鸟枪法测序,共得到包括2个β-琼胶酶、4个甘露聚糖酶、1个纤维二糖水解酶,1个果胶裂解酶、1个海藻糖水解酶和3个底物未知的多糖降解酶在内的12个分泌型多糖降解酶的基因。这12条酶的序列中含有Ⅰ型或Ⅱ型信号肽序列、与已鉴定功能的酶相似性普遍低于50%、且模块结构及其组成较新颖。其中,琼胶酶AgaG4含新型模块组成(GH16/ChtBD3)、AgaB8模块结构未知。研究还发现,用于鸟枪法测序的克隆R012和R093含其中8条基因,这些基因或所在操纵子的上游调控区缺少-10、-35、RBS等常见的启动子基序,可能是导致底物诱导表达法筛选文库失败的首要原因。本文首次报道Flammeovirga属细菌的多糖降解酶及其基因的序列特征,与已知物种的差异较为显著。