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柽柳过氧化物酶基因的序列分析及功能验证

姜静  郭晓红  李慧玉  王玉成  王柏臣  杨传平  
【摘要】:过氧化物酶(peroxidase,POD)是植物酶促脱毒机制中的一种酶,该酶对H2O2的亲和力是过氧化氢酶的1000倍,在活性氧的清除中起着重要的作用。为了探讨POD基因在非生物胁迫下的表达模式以及生物学功能,本研究从柽柳(Tam arix androssow ii)cDNA文库中测序得到一条长度为1376 bp、编码362个氨基酸的ThPOD基因,对该基因进行生物信息学分析,确定其属于植物第Ⅲ类过氧化物酶超家族成员之一,为典型的分泌型过氧化物酶。逆境条件下实时荧光定量PCR对ThPOD基因的转录表达特性分析表明,柽柳ThPOD基因能够对盐、冷、重金属、干旱引起的氧化损伤产生应答反应,并且该基因在根中的表达量明显高于叶中的表达量。此外,ABA能够诱导ThPOD基因在根和叶组织中大量表达,推测其为ABA依赖型。根据ThPOD的蛋白质结构功能域,构建了2种短肽缺失克隆,即RG/pET32a-ThPOD_((aa41-337))(编码植物过氧化物酶功能区)和RG/pET32a-ThPOD_((aa73-337))(编码抗坏血酸过氧化物酶功能区),以及含ThPOD全长cDNA的RG/pET32a-ThPOD重组菌。经诱导表达后SDS-PAGE、Western blot分析表明,这些重组菌表达的特异条带均为目的多肽。重组菌株在NaCl和PEG胁迫条件下的生长曲线和存活率分析表明,RG/pET32a-ThPOD, RG/pET32a-ThPOD_((41-337 aa))和RG/pET32a-ThPOD_((73-337 aa))重组大肠杆菌抵御盐和干旱胁迫的能力强于对照菌株RG/pET32a,NaCl和PEG胁迫条件下RG/pET32a-ThPOD_((73-337 aa))菌株的存活率分别是对照RG/ pET32a的2倍和10倍,表明RG/pET32a-ThPOD_((73-337 aa))抵御非生物胁迫的能力最强。

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