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《第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)论文摘要汇编》2009年
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Huntington舞蹈症基因诊断的研究

马明义  杨元  陈朴  张思仲  
【摘要】:目的为避免IT15基因(CAG)n重复区和(CCG)n重复区之间12个突变热点区碱基变异对Huntington舞蹈症基因诊断造成的漏诊,探讨扩增(CAG)n+(CCG)n重复区,毛细管电泳和Southern blotting对Huntington舞蹈症的基因诊断方法。方法①四川大学华西医院神经内科临床诊断为Huntington舞蹈症无血缘关系的疑似病例36人,自行设计引物扩增,1.5%琼脂糖电泳,对电泳结果显示片断长度异常的个体,大小片断胶回收后克隆测序。②挑选(CAG)n+(CCG)n克隆测序片断长度分别为123bp,126bp,129bp,132bp,135bp,180bp,201bp,207bp,210bp,243bp的质粒,酶切把插入的片断切下来,胶回收稀释后做模板,PCR扩增后行ABI310毛细管电泳,毛细管电泳显示的带的大小和测序结果进行比较,建立一套该位点序列的毛细管电泳内标。③上游引物5'端FAM标记,扩增(CAG)n+(CCG)n重复区片断进行ABI310毛细管电泳,依据自己建立的内标,读出片断的长度。④自行设计引物对正常人群中68个无血缘关系个体(CCG)n重复区进行测序,统计不同CCG重复次数在正常人群中的分别频率。⑤2人毛细管电泳只见一等位片断,为排除异常等位片断未能扩增出来的可能,对此2人标本进行Southern blotting分析:用pstⅠ内切酶切基因组DNA,在CAG重复区上游设计一对引物,扩增497bp的片断,克隆测序正确后,质粒酶切下插入的片断,胶回收后用罗氏随机引物标记试济盒标记探针,用罗氏抗地高锌抗体检测试济盒对尼龙膜上印迹的核酸进行检测。结果①共诊断出24个Huntington舞蹈症患者,最大重复次数56次;10个人因大小等位片断都处于正常的范围,故排除IT15基因CAG扩增异常;其余2人Southern blotting分析,未发现CAG异常重复的证据。②123bp 126bp 129bp 132bp 135bp的片断毛细管电泳的结果比实际的片断长度平均约小6个碱基bp,180bp 201bp 207bp 210bp 243bp的片断毛细管电泳的结果比实际的片断平均约小9个碱基。故毛细管电泳在诊断动态突变类疾病片断长度是否异常时应考虑进行适当的校正。③中国正常汉族人群中CCG重复的次数及频率分别为:7(50%),10(38.4%),9(7.14%,8(2.68%),6 (1.79%),而Huntington舞蹈病患者中CCG重复次数分布频率为:10(71.4%),7(21.4%)6(7.1%),其中10最多,和正常人比较P0.05,这表明ITl5基因CAG异常重复扩增常和10次CCG重复连锁,推测Huntington舞蹈病可能存在建立者效应。④由于正常人群中CCG重复次数变异不大,最多也是10次,故PCR扩增(CAG)n+(CCG)n重复区对诊断Huntington舞蹈症CAG异常重复与否影响不大。
【作者单位】:四川大学华西医院医学遗传室
【分类号】:R742.2

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