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《第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)论文摘要汇编》2009年
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小鼠睾丸特异基因Fank1基因敲减转基因小鼠模型的建立

董婉维  郑志红  
【摘要】:目的利用RNA干扰技术建立小鼠睾丸特异基因(Fank1)基因敲减转基因小鼠动物模型,为进一步研究睾丸特异基因Fank1在精子发生过程中的作用机制。方法根据Fank1基因cDNA序列设计2条干扰序列,经退火形成dsoligo,分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSuper-neo-GFP中,构建重组质粒,同时构建Fank1基因与红色荧光蛋白表达融合载体。采用脂质体法将2个Fank1基因干扰载体及阴性对照分别与Fank1基因表达载体共转染293T细胞,计算转染率,并观察siRNA对Fank1基因的抑制效应及红色荧光蛋白表达情况。选取抑制效率较高的pSuper-shFank1重组质粒,通过显微注射方法将单酶切的pSuper-shFank1基因注射入BDF1小鼠的受精卵中,将注射后存活的胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠。分别采用PCR和Southern blot方法检测DNA是否整合入小鼠基因组;通过RT-PCR、Westem blot方法检测Fank1基因表达,并对shFank1基因敲减转基因小鼠传代功能分析。结果经测序分析重组质粒pSuper-shFank1 631#,pSuper-shFank1 247#及pdsRED-Fank1表达载体构建正确。瞬时转染293T细胞,细胞转染效率为95%。转染36h后荧光显微镜检查发现2个siRNA质粒均能明显抑制红色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot结果表明Fank1基因在mRNA和蛋白质水平都被显著抑制,抑制效率分别为95%和90%。选取重组质粒pSuper-shFank1 631#通过显微注射到小鼠受精卵中,共注射285枚胚胎,存活203枚,将注射后存活的受精卵分别移植到8个ICR假孕母鼠输卵管内,共产仔53只,经PCR及Southern blot检测后共14只阳性小鼠。阳性率为26.42%。对雄性转基因小鼠子代进行RT-PCR和Western blot检测,Fank1基因在基因敲减转基因小鼠睾丸组织中表达降低。Fank1基因敲减雄性小鼠与正常雄性小鼠相比精子数量减少,并且产仔周期和产仔数量都有明显差异p0.05。结论建立了Fankl基因敲减转基因小鼠为研究Fank1基因在精子生成过程中的作用奠定了基础。

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