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HBG1和TFRC基因的克隆与原核表达

袁媛  周新  
【摘要】:目的采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记,并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术,是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的最佳手段。但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体,故不同学者选用的标记性抗体也有所不同。胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)与转铁蛋白受体(transferring receptor,TFRC)单克隆抗体联合应用,能大大提高分离胎儿有核红细胞的准确率。原核表达胎儿特异性血红蛋白γ链(hemoglobin gamma A,HBG1)与TFRC,为制备特异性单克隆抗体标记做基础,以期应用于胎儿有核红细胞标记。方法依据GeneBank中NM_000559 HBG1序列和NM_003234 TFRC序列亲水区,分别用TRIZOL提取人胎盘组织及肝细胞癌细胞Hep3B中的总RNA,经RT-PCR从人胎盘组织cDNA中扩增出HBG1,并采用HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,引物序列:HBG1-F 5'-CAGAAGCTTGTATGGGTCATTTCACAGAGGA-3';HBG1-R:5'- ATACTCGAGTCAGTGGTATCTGGAGGACAGG-3';同时,从Hep3 B细胞cDNA中扩增TFRC,设计带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,序列为:TFRC-F:5'-AATGGATCCGGCGATAACAGTCATGTGGA-3',TFRC-R:5'-GGACTCGAGT TTAGTACCAAAATTAGCATG -3'。将HBG1及TFRC的PCR产物凝胶回收后,连接至双酶切后的Pet28a质粒,转化至感受态BL21,筛选经测序验证的阳性克隆后,IPTG诱导HBG1与TFRC基因的表达。结果测序显示带有HBG1基因的Pet28a质粒与带有TFRC基因的Pet28a质粒构建成功,经表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,IPTG诱导表达出分子量分别大约在19kDa和21kDa的HBG1蛋白及TFRC亲水区蛋白。结论HBG1蛋白和TFRC亲水区蛋白原核表达成功,可用于进一步的表达纯化及单克隆抗体的制备。

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