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《中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)》2008年
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构建评价fC31整合酶功能的双荧光报告系统

徐焕宇  马晴雯  黄淑帧  曾凡一  
【摘要】:fC31整合酶是一种位点特异的重组酶,属于丝氨酸重组酶家族,它可催化噬菌体基因组中 attP 位点(phage attachment site)与链霉菌基因组中 att3位点(bacterial attachment site)之间的重组反应。重组使噬菌体基因组整合到链霉菌基因组中,并产生杂合位点 attL 和 attR。fC31/att 系统已成为 cre/loxp 系统之外另一种强有力的基因操作工具,在基因治疗、转基因动物生产以及基因工程领域极具应用潜力。虽然酪氨酸家族重组酶 Cre、FLP 等其他重组酶也可以介导基因重组,但它们催化的重组反应是可逆的。而 fC31整合酶介导的重组反应生成的 attL 和 attR 无法再作为整合酶重组的底物,因此反应是单向的。与 Cre 酶类似, 相同或不同方向的 attP 位点和 attB 位点在同一质粒分子内部时,被 fC31整合酶催化可导致缺失或倒位的重组结果。当这2个位点定位在不同的 DNA 分子之间时,重组导致一种整合作用。这一特点是 Cre 酶所不具有的。此外,对 fC31 整合酶研究发现:在人、小鼠、大鼠、牛、兔等多种哺乳动物以及果蝇中存在并鉴定了一系列 fC31整合酶可以识别的假 attP 位点,这些位点是序列特异性的。更重要的是,fC31整合酶可以介导含 attB 位点及外源基因的质粒高效整合到哺乳动物基因组假 attP 位点上,并可获得较高的外源基因表达水平。这一独有的特点使 fC31整合酶在基因治疗中比 Cre 酶具有更为广阔的优势。在动物实验水平,已有多种基因缺陷导致的遗传病(如血友病、杜氏肌营养不良症、人皮肤病以及小鼠遗传性Ⅰ型酪氨酸血症等)应用该系统得到良好的改善。对于 fC31整合酶重组能力的评价,一些研究者应用强启动子驱动 attB/attP flanked DNA cassette(STOP cassette or neo gene)和 LacZ 基因作为报告载体,应用 X-gal 染色反映 LacZ 基因的表达。但这种方法费时费力,并且无法在活细胞中进行。为了克服上述缺陷,探索一种能在活细胞内更加快捷的检测 fC31整合酶的重组能力的方法,本研究结合 fC31/att 系统和红绿荧光蛋白构建了可在活细胞中检测 fC31整合酶的双色荧光交替系统。当不存在 fC31整合酶时,红色荧光表达:当存在 fC31整合酶并催化重组反应时,表达绿色荧光。在 NIH3T3细胞中以该报告系统与 fC31整合酶的不同比例(1: 0.1:100,1:10,1:1,10:1和100:1)瞬时转染细胞,结果发现,随着 fC31整合酶比例的增加,细胞中红色荧光转换为绿色荧光的比率增加。而在1:10的比例时转换效率最高,fC31 整合酶可催化近90%的红色荧光转换为绿色荧光。结果可以通过流式细胞仪快速检测。此外, 在报告系统稳定整合的细胞基因组内,同样观测到 fC31整合酶催化重组而产生的红色荧光转换为绿色荧光。综上所述,应用本研究建立的 fC31整合酶双色荧光报告系统并结合流式细胞仪可以检测活体细胞中 fC31整合酶的重组能力,从而为 fC3l整合酶的重组能力的检测提供了一条更加快捷的量化途径。

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